Hatur nuhun pikeun ngadatangan Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS kawates. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun yén anjeun nganggo browser anu diropéa (atanapi nganonaktipkeun Mode Kasaluyuan dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal ngajantenkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Thermophiles nyaéta mikroorganisme anu mekar dina suhu luhur. Diajar aranjeunna tiasa masihan inpormasi anu berharga ngeunaan kumaha kahirupan adaptasi kana kaayaan anu ekstrim. Tapi, hese pikeun ngahontal kondisi suhu luhur ku mikroskop optik konvensional. Sababaraha solusi home-dijieun dumasar kana pemanasan listrik résistif lokal geus diajukeun, tapi euweuh solusi komérsial basajan. Dina makalah ieu, urang ngenalkeun konsép pemanasan laser microscale dina widang mikroskop pikeun nyadiakeun suhu luhur pikeun studi thermophile bari tetep lingkungan pamaké hampang. Pemanasan skala mikro dina inténsitas laser sedeng tiasa dihontal nganggo substrat anu dilapis nanopartikel emas salaku panyerep cahaya anu biokompatibel sareng efisien. Pangaruh kamungkinan konveksi cairan skala mikro, ingetan sél, sareng gerak thermophoretic centrifugal dibahas. Metoda ieu geus ditémbongkeun dina dua spésiés: (i) Geobacillus stearothermophilus, hiji baktéri thermophilic aktif nu baranahan dina ngeunaan 65 ° C, nu urang geus observasi pikeun berkecambah, tumuwuh sarta ngojay dina microscale pemanasan; (ii) Thiobacillus sp., hiji archaea hyperthermophilic optimal. dina 80 ° C. Karya ieu muka jalan pikeun observasi basajan tur aman mikroorganisme thermophilic ngagunakeun parabot mikroskop modern jeung affordable.
Leuwih milyaran taun, kahirupan di Bumi geus mekar pikeun adaptasi jeung rupa-rupa kaayaan lingkungan nu kadang dianggap ekstrim tina sudut pandang manusa urang. Khususna, sababaraha mikroorganisme thermophilic (baktéri, archaea, fungi) disebut thermophiles mekar dina rentang suhu ti 45 ° C nepi ka 122 ° C1, 2, 3, 4. Thermophiles hirup di sagala rupa ékosistem, kayaning vents hydrothermal laut jero, cinyusu panas. atawa wewengkon vulkanik. Panalitianna parantos ngahasilkeun seueur minat salami sababaraha dekade katukang sahenteuna dua alesan. Mimiti, urang tiasa diajar ti aranjeunna, contona, kumaha thermophiles 5, 6, énzim 7, 8 sareng mémbran 9 stabil dina suhu anu luhur, atanapi kumaha thermophiles tiasa tahan tingkat radiasi anu ekstrim10. Kadua, aranjeunna mangrupikeun dasar pikeun seueur aplikasi biotéhnologi penting1,11,12 sapertos produksi suluh13,14,15,16, sintésis kimia (dihidro, alkohol, métana, asam amino, jsb.)17, biomining18 sareng biokatalis termostabil7,11, 13. Khususna, réaksi ranté polimérase (PCR)19 anu kawéntar ayeuna ngalibatkeun énzim (Taq polymerase) anu diisolasi tina baktéri thermophilic Thermus aquaticus, salah sahiji thermophiles munggaran anu kapanggih.
Sanajan kitu, ulikan ngeunaan thermophiles teu hiji tugas gampang tur teu bisa improvised di mana wae laboratorium biologis. Khususna, termofil hirup teu tiasa dititénan sacara in vitro nganggo mikroskop cahaya standar, sanaos sareng kamar pemanasan anu sayogi komersil, biasana dipeunteun pikeun suhu dugi ka 40 ° C. Ti taun 1990-an, ngan sababaraha grup panalungtikan anu ngadedikasikeun diri pikeun ngenalkeun sistem mikroskop suhu luhur (HTM). Taun 1994 Glukh et al. The pemanasan / cooling chamber ieu katimu dumasar kana pamakéan sél Peltier nu ngatur suhu kapilér rectangular ditutup pikeun ngajaga anaérobik 20 . Alatna tiasa dipanaskeun dugi ka 100 °C dina laju 2 °C/s, ngamungkinkeun para pangarang pikeun ngulik motilitas baktéri hyperthermophilic Thermotoga maritima21. Dina 1999 Horn et al. Hiji alat sarupa pisan geus dimekarkeun, masih dumasar kana pamakéan kapilér dipanaskeun cocog pikeun mikroskop komérsial diajar division sél / sambungan. Saatos periode lila teu aktipitas relatif, pilarian pikeun HTMs éféktif dihanca dina 2012, hususna dina sambungan kalawan runtuyan tulak ku grup Wirth anu ngagunakeun alat invented by Horn et al. Lima belas taun ka tukang, motilitas sajumlah badag archaea, kaasup hyperthermophiles, diulik dina suhu nepi ka 100 ° C ngagunakeun kapiler dipanaskeun23,24. Éta ogé dirobah mikroskop aslina pikeun ngahontal pemanasan gancang (sababaraha menit tinimbang 35 menit pikeun ngahontal suhu set) jeung ngahontal gradién hawa linier leuwih ti 2 cm sakuliah sedeng. Alat ngabentuk gradién suhu ieu (TGFD) parantos dianggo pikeun ngulik mobilitas seueur thermophiles dina gradién suhu dina jarak anu relevan sacara biologis 24, 25.
Pemanasan kapilér katutup sanés hiji-hijina cara pikeun niténan thermophiles hirup. Dina 2012, Kuwabara et al. Kamar Pyrex disposable homemade disegel ku napel tahan panas (Super X2; Cemedine, Jepang) dipaké. Sampel ieu disimpen dina piring pemanasan transparan sadia komersil (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Jepang) sanggup pemanasan nepi ka 110 ° C, tapi aslina teu dimaksudkeun pikeun bioimaging. Nu nulis niténan division efisien baktéri thermophilic anaérobik (Thermosipho globiformans, waktos duka kali 24 mnt) dina 65 ° C. Dina 2020, Pulshen et al. pemanasan efisien masakan logam komérsial (Attofluor TM, Thermofisher) ieu nunjukkeun ngagunakeun dua elemen pemanasan homemade: tutup sarta panggung (konfigurasi mesin-diideuan PCR). Asosiasi ieu nyababkeun suhu cairan anu seragam sareng nyegah évaporasi sareng kondensasi di handapeun tutup. Pamakéan O-ring ngahindarkeun bursa gas sareng lingkungan. HTM ieu, disebut Sulfoscope, dipaké pikeun gambar Sulfolobus acidocaldarius dina 75 ° C27.
Watesan anu diakui pikeun sadaya sistem ieu nyaéta larangan pikeun pamakean tujuan hawa, naon waé immersion minyak henteu cocog pikeun suhu anu luhur sareng pikeun pencitraan ngaliwatan sampel transparan kandel> 1-mm. Watesan anu diakui pikeun sadaya sistem ieu nyaéta larangan pikeun pamakean tujuan hawa, naon waé immersion minyak henteu cocog pikeun suhu anu luhur sareng pikeun pencitraan ngaliwatan sampel transparan kandel> 1-mm. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, посколмькужов, посколмькужу ение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщ1инмой. Kakurangan anu diakuan tina sadaya sistem ieu nyaéta watesan pikeun pamakean tujuan hawa, sabab immersion minyak henteu cocog pikeun suhu anu luhur sareng pikeun visualisasi ngaliwatan conto transparan> 1 mm kandel.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的1合这样厚的透明样品成像。 Watesan anu diakuan tina sadaya sistem ieu nyaéta watesan ngagunakeun eunteung anu aya dina hawa, sabab immersion minyak henteu cocog pikeun ngagambar conto transparan anu kandel> 1 mm dina suhu anu luhur. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, люмурыв масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. Kakurangan anu diakuan tina sadaya sistem ieu nyaéta panggunaan lénsa hawa anu kawates, immersion minyak naon waé henteu cocog pikeun suhu anu luhur sareng visualisasi ngaliwatan conto transparan> 1 mm kandel.Nu leuwih anyar, watesan ieu diangkat ku Charles-Orzag et al. 28, anu ngembangkeun hiji alat nu euweuh nyadiakeun panas sabudeureun sistem dipikaresep, tapi rada jero kaca panutup sorangan, ditutupan ku lapisan transparan ipis résistor dijieunna tina ITO (indium-tin oksida). Tutupna bisa dipanaskeun nepi ka 75 °C ku cara ngalirkeun arus listrik ngaliwatan lapisan transparan. Nanging, panulis ogé kedah memanaskeun lensa ka obyektif, tapi henteu langkung ti 65 °C, supados henteu ngaruksak.
Karya-karya ieu nunjukkeun yén pamekaran mikroskop optik suhu luhur anu éfisién henteu acan diadopsi sacara lega, sering meryogikeun alat-alat buatan bumi, sareng sering dihontal kalayan biaya résolusi spasial, anu mangrupikeun karugian anu serius nunjukkeun yén mikroorganisme thermophilic henteu langkung ageung tibatan sababaraha. mikrométer. Ngurangan volume pemanasan mangrupakeun konci pikeun ngarengsekeun tilu masalah alamiah HTM: resolusi spasial goréng, inersia termal tinggi nalika sistem heats up, sarta pemanasan ngabahayakeun tina elemen sabudeureun (minyak immersion, lensa obyektif ... atawa leungeun pamaké) dina suhu ekstrim. ).
Dina makalah ieu, urang ngenalkeun HTM pikeun observasi thermophile anu henteu dumasar kana pemanasan résistif. Gantina, urang ngahontal pemanasan localized dina wewengkon kawates widang mikroskop urang of view ku irradiation laser tina substrat nyerep lampu. Distribusi suhu divisualisasikeun nganggo mikroskop fase kuantitatif (QPM). Éféktivitas métode ieu dibuktikeun ku Geobacillus stearothermophilus, baktéri termofilik motil anu baranahan kira-kira 65°C jeung boga waktu ngagandakeun pondok (kira-kira 20 menit), sarta Sulfolobus shibatae, hyperthermophile anu tumuwuh optimal dina suhu 80°C (archaea). pikeun ngagambarkeun. Laju réplikasi normal sareng ngojay dititénan salaku fungsi suhu. Laser HTM ieu (LA-HTM) henteu diwatesan ku ketebalan panutup panutup atawa ku alam obyektif (udara atawa minyak immersion). Hal ieu ngamungkinkeun sagala lénsa resolusi luhur dina pasaran bisa dipaké. Ogé teu kakurangan tina pemanasan laun alatan inersia termal (ngahontal pemanasan instan dina skala milidetik) sarta ngagunakeun ukur komponén sadia komersil. Hiji-hijina masalah kaamanan anyar aya hubunganana sareng ayana sinar laser anu kuat (biasana dugi ka 100 mW) di jero alat sareng kamungkinan ngalangkungan panon, anu peryogi kacasoca pelindung.
Prinsip LA-HTM nyaéta ngagunakeun laser pikeun panas sampel lokal dina widang view tina mikroskop (Gbr. 1a). Jang ngalampahkeun ieu, sampel kudu nyerep lampu. Pikeun ngagunakeun kakuatan laser lumrah (kirang ti 100 mW), urang teu ngandelkeun nyerep cahaya ku medium cair, tapi artifisial ngaronjat nyerep sampel ku palapis substrat jeung nanopartikel emas (Gbr. 1c). Pemanasan nanopartikel emas kalayan cahaya penting pisan pikeun widang plasmonik termal, kalayan aplikasi anu dipiharep dina biomedis, nanokimia atanapi panén sinar panonpoé29,30,31. Dina sababaraha taun katukang, kami parantos ngagunakeun LA-HTM ieu dina sababaraha studi anu aya hubunganana sareng aplikasi plasma termal dina fisika, kimia sareng biologi. Kasusah utama dina metoda ieu nyaeta dina mintonkeun profil suhu ahir, saprak suhu elevated diwatesan ka wewengkon microscale dina sampel. Kami parantos nunjukkeun yén pemetaan suhu tiasa dihontal ku interferometer geser transversal opat-gelombang, metode anu sederhana, resolusi luhur, sareng sensitip pisan tina mikroskop fase kuantitatif dumasar kana panggunaan gratings difraksi dua diménsi (ogé katelah gratings silang). 33,34,35,36. Kaandalan téknik mikroskop termal ieu, dumasar kana crossed grating wavefront microscopy (CGM), parantos nunjukkeun dina belasan makalah anu diterbitkeun dina dékade katukang37,38,39,40,41,42,43.
Skéma pamasangan pemanasan laser paralel, bentukna sareng mikroskop suhu. b Géométri sampel diwangun ku hiji chamber AttofluorTM ngandung hiji coverslip coated kalawan nanopartikel emas. c Tingali taliti dina sampel (teu skala). d ngagambarkeun profil sinar laser seragam jeung (e) simulasi sebaran hawa saterusna dina pesawat sampel tina nanopartikel emas. f mangrupa profil sinar laser annular cocog pikeun ngahasilkeun suhu seragam ditémbongkeun saperti dina simulasi tina sebaran hawa hasilna ditémbongkeun dina (g). Skala bar: 30 µm.
Khususna, urang nembé ngahontal pemanasan sél mamalia sareng LA-HTM sareng CGM sareng ngalacak réspon kejutan panas sélular dina kisaran 37-42 ° C, nunjukkeun katepatan tina téknik ieu pikeun pencitraan sél hirup tunggal. Sanajan kitu, aplikasi LA-HTM kana ulikan ngeunaan mikroorganisme dina suhu luhur teu unambiguous, sabab merlukeun leuwih caution dibandingkeun sél mamalia: firstly, pemanasan handap medium ku puluhan derajat (tinimbang sababaraha derajat) ngabalukarkeun ka gradién suhu nangtung kuat. bisa nyieun convection cairan 44 nu, lamun teu pageuh napel substrat, bisa ngabalukarkeun gerakan pikaresepeun tur Pergaulan baktéri. convection Ieu bisa ngaleungitkeun ku cara ngurangan ketebalan tina lapisan cair. Pikeun tujuan ieu, dina sakabéh percobaan dibere handap, suspensions baktéri disimpen antara dua coverslips kira 15 µm kandel disimpen di jero cangkir logam (AttofluorTM, Thermofisher, Gbr. 1b,c). Sacara prinsip, convection bisa dihindari lamun ketebalan cairanana leuwih leutik batan ukuran beam tina laser pemanasan. Bréh, gawe dina géométri kawates misalna bisa ngaleutikan organisme aérobik (tingali Gbr. S2). Masalah ieu bisa dihindari ku ngagunakeun substrat anu permeabel ka oksigén (atawa gas vital sejenna), ku ninggalkeun gelembung hawa trapped jero coverslip, atawa ku pangeboran liang dina coverslip luhur (tingali Gbr. S1) 45. Dina ulikan ieu, kami milih solusi anu terakhir (Gambar 1b sareng S1). Tungtungna, pemanasan laser teu nyadiakeun distribusi suhu seragam. Malah dina inténsitas sarua tina sinar laser (Gbr. 1d), sebaran suhu teu seragam, tapi rada nyarupaan sebaran Gaussian alatan difusi termal (Gbr. 1e). Nalika tujuanana nyaéta pikeun netepkeun suhu anu tepat dina bidang pandang pikeun diajar sistem biologis, profil anu henteu rata henteu idéal sareng ogé tiasa nyababkeun gerakan thermophoretic baktéri upami henteu patuh kana substrat (tingali Gbr. S3, S4)39. Pikeun tujuan ieu, kami nganggo modulator cahaya spasial (SLM) pikeun ngabentuk sinar laser infra red nurutkeun bentuk cingcin (Gbr. 1f) dina pesawat sampel pikeun ngahontal sebaran suhu sampurna seragam dina wewengkon geometri nu tangtu. sanajan difusi termal (Gbr. 1d) 39, 42, 46. Teundeun coverslip luhur leuwih piring logam (Gambar 1b) pikeun nyegah évaporasi tina sedeng jeung niténan salila sahenteuna sababaraha poé. Kusabab coverslip luhur ieu teu disegel, sedeng tambahan bisa gampang ditambahkeun iraha wae lamun perlu.
Pikeun ngagambarkeun kumaha jalanna LA-HTM sareng nunjukkeun aplikasina dina panalungtikan termofilik, urang nalungtik baktéri aérobik Geobacillus stearothermophilus, anu gaduh suhu pertumbuhan optimum sakitar 60-65°C. Baktéri ogé boga flagella jeung kamampuhan pikeun ngojay, nyadiakeun indikator séjén aktivitas sélular normal.
Sampel (Gbr. 1b) anu pre-incubated dina 60 ° C salila sajam lajeng disimpen dina wadah sampel LA-HTM. Pra-inkubasi Ieu pilihan, tapi masih mangpaat, pikeun dua alesan: Kahiji, nalika laser dihurungkeun, ngabalukarkeun sél langsung tumuwuh sarta ngabagi (tingali pilem M1 dina Bahan Suplemén). Tanpa pre-inkubasi, tumuwuhna baktéri ilaharna nyangsang ku ngeunaan 40 menit unggal waktos wewengkon nempoan anyar dipanaskeun dina sampel. Kadua, 1 jam pre-inkubasi diwanohkeun adhesion baktéri kana coverslip nu, nyegah sél drifting kaluar tina widang view alatan thermophoresis nalika laser dihurungkeun (tingali pilem M2 dina Bahan Suplemén). Térmoforésis nyaéta gerak partikel atawa molekul sapanjang gradién suhu, biasana tina panas nepi ka tiis, jeung baktéri teu iwal43,47. Pangaruh anu teu dihoyongkeun ieu dileungitkeun dina daérah anu dipasihkeun ku ngagunakeun SLM pikeun ngabentuk sinar laser sareng ngahontal distribusi suhu anu datar.
Dina Gbr. angka 2 nembongkeun sebaran suhu diukur ku CGM diala ku irradiating substrat kaca coated kalawan nanopartikel emas kalawan sinar laser annular (Gbr. 1f). Distribusi suhu datar dititénan dina sakumna daérah anu katutupan ku sinar laser. Zona ieu disetel ka 65 ° C, suhu pertumbuhan optimal. Di luar daérah ieu, kurva suhu sacara alami turun ka \(1/r\) (dimana \(r\) nyaéta koordinat radial).
peta Suhu pangukuran CGM diala ku ngagunakeun sinar laser annular pikeun irradiate lapisan nanopartikel emas pikeun ménta profil suhu datar ngaliwatan wewengkon sirkular. b Isoterm tina peta suhu (a). Kontur sinar laser digambarkeun ku bunderan dotted abu. Percobaan diulang dua kali (tingali Bahan Suplemén, Gambar S4).
Daya tahan sél baktéri diawaskeun sababaraha jam nganggo LA-HTM. Dina Gbr. 3 nembongkeun interval waktu pikeun opat gambar nu dicokot tina pilem 3 jam 20 menit (Pilem M3, Émbaran Suplemén). Baktéri dititénan aktip proliferasi dina wewengkon sirkular ditetepkeun ku laser dimana hawa éta optimal, approaching 65 ° C. Sabalikna, tumuwuhna sél nyata ngurangan nalika hawa turun handap 50 ° C salila 10 detik.
Gambar jero optik baktéri G. stearothermophilus tumuwuh sanggeus pemanasan laser dina waktu nu beda, (a) t = 0 mnt, (b) 1 h 10 mnt, (c) 2 h 20 mnt, (d) 3 h 20 mnt, kaluar tina 200 Sasari tina pilem hiji menit (film M3 disadiakeun dina Émbaran Suplemén) superimposed dina peta suhu pakait. Laser hurung dina waktos \(t=0\). Isotherms geus ditambahkeun kana gambar inténsitas.
Pikeun salajengna ngitung tumuwuhna sél jeung gumantungna kana suhu, urang ngukur kanaékan biomassa rupa koloni baktéri mimitina terasing dina widang Movie M3 of view (Gbr. 4). Baktéri induk anu dipilih dina mimiti formasi unit pembentuk koloni mini (mCFU) dipidangkeun dina Gambar S6. Pangukuran massa garing dicandak nganggo kaméra CGM 48 anu dianggo pikeun peta distribusi suhu. Kamampuh CGM pikeun ngukur beurat garing sareng suhu nyaéta kakuatan LA-HTM. Saperti nu diharapkeun, suhu luhur ngabalukarkeun tumuwuhna baktéri gancang (Gbr. 4a). Ditémbongkeun saperti dina plot semi-log dina Gbr. 4b, tumuwuhna dina sagala suhu nuturkeun tumuwuhna éksponénsial, dimana data ngagunakeun fungsi éksponénsial \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), dimana \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}2\) – waktu generasi (atawa waktu duka kali), \(g =1/ \tau\) – laju tumuwuh (jumlah divisi per unit waktu). Dina Gbr. 4c nembongkeun laju tumuwuh masing-masing jeung waktu generasi salaku fungsi suhu. MCFUs tumuwuh gancang dicirikeun ku jenuh tumuwuhna sanggeus dua jam, hiji kabiasaan ekspektasi alatan kapadetan baktéri tinggi (sarupa jeung fase cicing dina budaya cair klasik). Bentuk umum \ (g \ kénca (T \ katuhu) \) (Gbr. 4c) pakait jeung ekspektasi kurva dua-fase pikeun G. stearothermophilus kalawan laju tumuwuh optimal sabudeureun 60-65 ° C. Cocogkeun data ngagunakeun modél kardinal (Gambar S5)49 dimana \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, nu satuju pisan jeung niléy séjén nu dicutat dina literatur49. Sanajan parameter nu gumantung suhu bisa diulang, laju tumuwuh maksimum \({G}_{0}\) bisa rupa-rupa ti hiji percobaan ka nu sejen (tingali inohong S7-S9 jeung pilem M4). Kontras jeung suhu pas parameter, nu kudu universal, laju tumuwuh maksimum gumantung kana sipat medium (kasadiaan gizi, konsentrasi oksigén) dina géométri microscale observasi.
a Tumuwuhna mikroba dina rupa-rupa suhu. mCFU: Unit Ngabentuk Koloni Miniatur. Data dicandak tina pidéo tina hiji baktéri anu tumuwuh dina gradién suhu (pilem M3). b Sarua jeung (a), skala semi-logaritmik. c Laju tumuwuh\(\tau\) jeung waktu generasi\(g\) diitung tina régrési liniér (b). Bar kasalahan horisontal: kisaran suhu dimana mCFUs ngalegaan kana widang pandang nalika kamekaran. Bar kasalahan nangtung: kasalahan standar régrési linier.
Salian tumuwuhna normal, sababaraha baktéri kadang floated kana pintonan salila pemanasan laser, nu mangrupa kabiasaan ekspektasi pikeun baktéri kalawan flagella. Pilem M5 dina inpormasi tambahan nunjukkeun kagiatan ngojay sapertos kitu. Dina percobaan ieu, radiasi laser seragam dipaké pikeun nyieun gradién suhu, ditémbongkeun saperti dina Gambar 1d, e jeung S3. angka 5 nembongkeun dua runtuyan gambar dipilih ti pilem M5 némbongkeun yén hiji baktéri némbongkeun gerakan arah bari sakabeh baktéri séjén tetep teu gerak.
Dua pigura waktu (a) jeung (b) némbongkeun ngojay dua baktéri béda ditandaan bunderan dotted. Gambar-gambar diékstrak tina pilem M5 (disadiakeun salaku bahan tambahan).
Dina kasus G. stearothermophilus, gerakan aktif baktéri (Gbr. 5) mimiti sababaraha detik sanggeus sinar laser dihurungkeun. Observasi ieu nekenkeun respon temporal mikroorganisme thermophilic ieu kanaékan suhu, sakumaha geus katalungtik ku Mora dkk. 24 . Topik motilitas baktéri komo térmotaksis tiasa digali deui nganggo LA-HTM.
Ngojay mikroba teu matak bingung jeung tipe séjén gerak fisik, nyaéta (i) gerak Brownian, nu katempona gerak kacau tanpa arah pasti, (ii) convection 50 jeung thermophoresis 43, diwangun dina drift biasa gerakan sapanjang hawa. gradién.
G. stearothermophilus dipikanyaho pikeun kamampuhna pikeun ngahasilkeun spora kacida tahan (formasi spora) nalika kakeunaan kaayaan lingkungan ngarugikeun salaku pertahanan a. Nalika kaayaan lingkungan jadi nguntungkeun deui, spora berkecambah, ngabentuk sél hirup jeung neruskeun tumuwuhna. Sanaos prosés sporulasi / pengecambahan ieu dipikanyaho, éta henteu kantos dititénan sacara real waktos. Ngagunakeun LA-HTM, urang ngalaporkeun dieu observasi mimiti kajadian pengecambahan di G. stearothermophilus.
Dina Gbr. 6a nembongkeun gambar time-Selang jero optik (OT) diala maké susunan CGM 13 spora. Pikeun sakabéh waktos kempelan (15 h 6 mnt, \ (t = 0 \) - awal pemanasan laser), 4 ti 13 spora germinated, dina titik waktu saterusna \ (t = 2 \) h, \ ( 3 \ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' jeung \(11\) h \(30\)'. Sanajan ngan hiji kajadian ieu ditémbongkeun dina Gambar 6, 4 acara pengecambahan bisa ditempo dina pilem M6 dina bahan tambahan. Narikna, pengecambahan sigana acak: henteu sadayana spora berkecambah sareng henteu berkecambah dina waktos anu sami, sanaos parobihan anu sami dina kaayaan lingkungan.
a Time-lapse diwangun ku 8 gambar OT (immersion minyak, 60x, 1,25 tujuan NA) jeung (b) évolusi biomassa G. stearothermophilus aggregates. c (b) Digambar dina skala semi-log pikeun nyorot linearitas laju tumuwuh (garis putus-putus).
Dina Gbr. 6b,c nembongkeun biomassa populasi sél dina widang view salaku fungsi waktu dina sakabéh periode ngumpulkeun data. Buruk gancang tina massa garing dititénan dina \(t=5\)h dina Gbr. 6b, c, alatan kaluarna sababaraha sél tina widang view. Laju tumuwuhna opat acara ieu \(0.77\pm 0.1\) h-1. Nilai ieu leuwih luhur ti laju tumuwuh pakait sareng Gambar 3. 3 jeung 4, dimana sél tumuwuh normal. Alesan pikeun ngaronjatna laju tumuwuhna G. stearothermophilus ti spora mah can écés, tapi ukuran ieu nyorot minat LA-HTM tur dianggo dina tingkat sél tunggal (atawa dina tingkat mCFU tunggal) pikeun leuwih jéntré ngeunaan dinamika hirup sél. .
Jang meberkeun demonstrate versatility of LA-HTM jeung kinerja na dina suhu luhur, urang nalungtik tumuwuhna Sulfolobus shibatae, a hyperthermophilic acidophilic archaea kalawan suhu tumuwuh optimum tina 80 ° C51. Dibandingkeun jeung G. stearothermophilus, archaea ieu ogé mibanda morfologi anu béda pisan, nyarupaan 1 spheres micron (cocci) tinimbang rod elongated (bacilli).
Gambar 7a diwangun ku gambar jero optik sequential of S. shibatae mCFU diala maké CGM (tingali pilem fitur M7 dina Bahan Suplemén). mCFU ieu tumuwuh di sabudeureun 73 ° C, handap suhu optimum tina 80 ° C, tapi dina rentang suhu pikeun tumuwuh aktip. Kami ningali sababaraha kajadian fisi anu ngajantenkeun mCFU sapertos mikrograpes archaea saatos sababaraha jam. Tina gambar OT ieu, biomassa mCFU diukur kana waktos sareng dibere dina Gambar 7b. Narikna, S. shibatae mCFUs némbongkeun pertumbuhan linier tinimbang tumuwuhna éksponénsial katempo kalayan G. stearothermophilus mCFUs. Aya sawala lila 52 ngeunaan sipat laju tumuwuh sél: bari sababaraha studi ngalaporkeun laju tumuwuhna mikroba nu sabanding jeung ukuranana (pertumbuhan éksponénsial), batur némbongkeun laju konstan (linier atawa bilinear tumuwuh). Salaku dipedar ku Tzur et al.53, ngabedakeun antara éksponénsial jeung (bi) pertumbuhan linier merlukeun precision of <6% dina ukuran biomassa, nu kaluar jangkauan pikeun paling téhnik QPM, malah ngalibetkeun interferometry. Salaku dipedar ku Tzur et al.53, ngabedakeun antara éksponénsial jeung (bi) pertumbuhan linier merlukeun precision of <6% dina ukuran biomassa, nu kaluar jangkauan pikeun paling téhnik QPM, malah ngalibetkeun interferometry. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измиостих для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Salaku dipedar ku Zur et al.53, ngabedakeun antara éksponénsial jeung (bi) pertumbuhan linier merlukeun <6% akurasi ukuran biomassa, nu unattainable pikeun kalolobaan métode QPM, sanajan ngagunakeun interferometry.Salaku dipedar ku Zur et al. 53, ngabedakeun antara éksponénsial jeung (bi) pertumbuhan linier merlukeun akurasi kirang ti 6% dina ukuran biomassa, nu unattainable pikeun kalolobaan métode QPM, sanajan interferometry dipaké. CGM ngahontal katepatan ieu kalayan akurasi sub-pg dina pangukuran biomassa36,48.
a Time-lapse diwangun ku 6 gambar OT (immersion minyak, 60x, NA obyektif 1.25) jeung (b) évolusi biomassa mikro-CFU diukur kalawan CGM. Tempo pilem M7 pikeun inpo nu leuwih lengkep.
Tumuwuhna linier sampurna S. shibatae teu kaduga jeung teu acan dilaporkeun. Tapi, pertumbuhan éksponénsial diperkirakeun, sahenteuna sabab kana waktu, sababaraha divisi 2, 4, 8, 16 ... sél kudu lumangsung. Urang hipotésis yén pertumbuhan linier bisa jadi alatan inhibisi sél alatan pakét sél padet, sakumaha pertumbuhan sél slows turun sarta ahirna ngahontal kaayaan dormant lamun dénsitas sél teuing tinggi.
Urang nyimpulkeun ku ngabahas lima titik dipikaresep di handap ieu: pangurangan volume pemanasan, pangurangan inersia termal, minat nanopartikel emas, minat mikroskop fase kuantitatif, sareng kisaran suhu anu mungkin dimana LA-HTM tiasa dianggo.
Dibandingkeun pemanasan résistif, pemanasan laser dipaké pikeun ngembangkeun HTM nawarkeun sababaraha kaunggulan, nu urang ngagambarkeun dina ulikan ieu. Khususna, dina media cair dina widang panempoan mikroskop, volume pemanasan dijaga dina sababaraha (10 μm) 3 jilid. Ku cara kieu, ngan ukur mikroba anu dititénan anu aktip, sedengkeun baktéri sanés anu dormant sareng tiasa dianggo pikeun ngulik sampelna - henteu kedah ngarobih sampel unggal waktos suhu énggal kedah dipariksa. Salaku tambahan, pemanasan microscale ngamungkinkeun pamariksaan langsung tina sauntuyan suhu anu ageung: Gambar 4c dicandak tina pilem 3-jam (Movie M3), anu biasana ngabutuhkeun persiapan sareng ujian sababaraha conto - hiji pikeun tiap sampel anu ditalungtik. y nyaéta suhu nu ngagambarkeun jumlah poé dina percobaan. Ngurangan volume dipanaskeun ogé ngajaga sakabéh komponén optik sabudeureun mikroskop, utamana lénsa obyektif, dina suhu kamar, nu geus jadi masalah utama Nyanghareupan ku masarakat jadi jauh. LA-HTM tiasa dianggo sareng lénsa naon waé, kalebet lénsa immersion minyak, sareng bakal tetep dina suhu kamar sanaos suhu anu ekstrim dina pandangan. Watesan utama metode pemanasan laser anu kami laporkeun dina ulikan ieu nyaéta sél anu henteu patuh atanapi ngambang tiasa jauh tina pandangan sareng sesah diajar. A workaround bisa jadi ngagunakeun lénsa magnification low pikeun ngahontal naékna hawa nu leuwih gede leuwih ti sababaraha ratus microns. Awas ieu dibarengan ku panurunan dina résolusi spasial, tapi lamun tujuanana pikeun nalungtik gerakan mikroorganisme, resolusi spasial tinggi teu diperlukeun.
Skala waktu pikeun pemanasan (jeung cooling) sistem \({{{{{\rm{\tau}}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) gumantung kana ukuranana , nurutkeun hukum \({{{({\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), dimana \ (L \ ) nyaéta ukuran karakteristik sumber panas (diaméter sinar laser dina ulikan urang nyaéta \ (L \ ngeunaan 100 \) μm), \ (D \) nyaéta diffusivity termal lingkungan (rata-rata di urang. kasus, kaca jeung cai Laju difusi\(D\ ngeunaan 2\fold {10}^{-7}\) m2/s. parobahan suhu, bisa diperkirakeun ngadegna sakedapan naékna suhu ieu teu ngan shortens durasi percobaan, tapi ogé ngamungkinkeun timing tepat \ (t = 0 \) pikeun sagala ulikan dinamis tina épék suhu.
Metoda anu diusulkeun kami tiasa dianggo pikeun substrat anu nyerep cahaya (contona, conto komérsial nganggo lapisan ITO). Sanajan kitu, nanopartikel emas bisa nyadiakeun nyerep tinggi dina infra red jeung nyerep low dina rentang katempo, ciri dimungkinkeun tina nu dipikaresep pikeun observasi optik éféktif dina rentang katempo, utamana lamun ngagunakeun fluoresensi. Sajaba ti éta, emas téh biocompatible, kimia inert, dénsitas optik bisa disaluyukeun tina 530 nm ka deukeut infra red, sarta persiapan sampel basajan tur ekonomis29.
Transverse grating wavefront microscopy (CGM) ngamungkinkeun teu ukur pemetaan suhu dina microscale, tapi ogé ngawaskeun biomassa, sahingga utamana mangpaat (lamun teu perlu) dina kombinasi kalayan LA-HTM. Sapanjang dasawarsa katukang, téknik mikroskop suhu anu sanés parantos dikembangkeun, khususna dina widang bioimaging, sareng kalolobaanana meryogikeun panggunaan panyilidikan fluoresensi sénsitip suhu54,55. Sanajan kitu, métode ieu geus dikritik sarta sababaraha laporan geus diukur parobahan suhu unrealistic dina sél, jigana alatan kanyataan yén fluoresensi gumantung kana sababaraha faktor lian ti suhu. Salaku tambahan, kalolobaan panyilidikan fluoresensi teu stabil dina suhu anu luhur. Ku alatan éta, QPM sarta hususna CGM ngagambarkeun téknik mikroskop suhu idéal pikeun diajar hirup dina suhu luhur ngagunakeun mikroskop optik.
Studi ngeunaan S. shibatae, anu hirup optimal dina 80 ° C, némbongkeun yén LA-HTM bisa dilarapkeun pikeun diajar hyperthermophiles, teu ngan thermophiles basajan. Sacara prinsip, teu aya watesna pikeun rentang hawa nu bisa ngahontal maké LA-HTM, komo hawa luhureun 100 ° C bisa ngahontal dina tekanan atmosfir tanpa ngagolakkeun, sakumaha nunjukkeun ku grup urang 38 dina aplikasi kimia hidrotermal di atmosfir. tekanan A. A laser dipaké pikeun pemanasan nanopartikel emas 40 dina cara nu sarua. Ku kituna, LA-HTM boga potensi pikeun dipaké pikeun niténan hyperthermophiles unprecedented kalawan mikroskop optik resolusi luhur standar dina kaayaan baku (ie dina kaayaan stress lingkungan).
Kabéh percobaan anu dipigawé maké mikroskop homemade, kaasup katerangan Köhler (kalawan LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), wadah specimen kalawan gerakan xy manual, tujuan (Olympus, 60x, 0.7 NA, hawa, LUCPlanFLN60X atanapi 60x, 1.25 NA, Oil). , UPLFLN60XOI), kaméra CGM (QLSI cross grating, 39 µm pitch, 0,87 mm ti Andor Zyla sensor kaméra) pikeun nyadiakeun inténsitas jeung wavefront Imaging, sarta kaméra sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, mode 16-bit, ti Hamamatsu) pikeun ngarekam data ditémbongkeun dina Gambar 5 (baktéri ngojay). Splitter beam dichroic mangrupikeun ujung BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Filter di hareup kaméra téh 694 pondok pass filter (FF02-694 / SP-25, Semrock). Titanium inten biru laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, ngompa rohangan laser tsunami, Spéktra-Fisika dina Gbr. 2-5, salajengna diganti ku laser Millenia, Spectraphysics 10 W, ngompa rohangan laser Mira, koheren, pikeun Gbr. 2. -5). 6 jeung 7) disetel ka panjang gelombang \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, nu pakait jeung spéktrum résonansi plasmon nanopartikel emas. Modulator cahaya spasial (1920 × 1152 piksel) dibeuli ti Meadowlark Optik.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) nyaéta téknik mikroskop optik dumasar kana ngagabungkeun grating difraksi dua diménsi (ogé katelah cross grating) dina jarak hiji milimeter ti sénsor kaméra konvensional. Conto paling umum tina CGM anu kami dianggo dina ulikan ieu disebut interferometer transverse shift opat-gelombang (QLSI), dimana kisi-silangan diwangun ku pola checkerboard inténsitas / fase anu diwanohkeun sareng dipaténkeun ku Primot dkk. di 200034. Garis grating nangtung sarta horizontal nyieun bayangan grid-kawas dina sensor, nu distorsi nu bisa diolah sacara numerik sacara real waktu pikeun ménta distorsi wavefront optik (atawa profil fase sarimbag) tina lampu kajadian. Lamun dipaké dina mikroskop, kaméra CGM bisa nembongkeun bédana jalur optik objék imaged, ogé katelah jero optik (OT), kalawan sensitipitas on ordo nanometer36. Dina sagala pangukuran CGM, pikeun ngaleungitkeun sagala cacad dina komponén optik atawa balok, rujukan primér gambar OT kudu dicokot tur dikurangan tina sagala gambar salajengna.
Mikroskopi suhu dilaksanakeun nganggo kaméra CGM sakumaha anu dijelaskeun dina rujukan. 32. Pondokna, pemanasan cairan ngarobah indéks réfraktif na, nyieun éfék lénsa termal nu distorts beam kajadian. Distorsi wavefront ieu diukur ku CGM tur diolah ngagunakeun algoritma deconvolution pikeun ménta distribusi suhu tilu diménsi dina medium cair. Upami nanopartikel emas disebarkeun merata sapanjang sampel, pemetaan suhu tiasa dilakukeun di daérah bébas baktéri pikeun ngahasilkeun gambar anu langkung saé, anu kadang urang laksanakeun. Gambar CGM rujukan ieu kaala tanpa pemanasan (kalawan laser dipareuman) sarta salajengna direbut dina lokasi anu sarua dina gambar jeung laser on.
Pangukuran massa garing dihontal nganggo kaméra CGM anu sami anu dianggo pikeun pencitraan suhu. Gambar rujukan CGM dicandak ku gancang ngagerakkeun sampel dina x jeung y salila paparan minangka sarana rata-rata sagala inhomogeneity dina OT alatan ayana baktéri. Tina gambar baktéri OT, biomassana dicandak nganggo ensemble gambar dina daérah anu dipilih nganggo algoritma segmentasi homemade Matlab (tingali subseksi "Kode Numerik"), nuturkeun prosedur anu dijelaskeun dina ref. 48. Singketna, urang ngagunakeun hubungan \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), dimana \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) nyaéta gambar jero optik, \(m\) nyaéta beurat garing sarta \({{{{\rm{\alfa}}}}}}}\) nyaéta konstanta. Urang milih \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, nu mangrupakeun konstanta has pikeun sél hirup.
Slip panutup diaméterna 25 mm sareng kandel 150 µm dilapis ku nanopartikel emas disimpen kana kamar AttofluorTM (Thermofisher) kalayan nanopartikel emas nyanghareup ka luhur. Geobacillus stearothermophilus ieu precultured sapeuting dina medium LB (200 rpm, 60 ° C) saméméh unggal poé percobaan. Serelek 5 µl suspénsi G. stearothermophilus kalawan kapadetan optik (OD) 0,3 nepi ka 0,5 ieu disimpen dina slip panutup kalawan nanopartikel emas. Teras, panutup panutup buleud diaméterna 18 mm kalayan liang 5 mm diaméterna di tengahna diturunkeun kana serelek, sareng 5 μl suspénsi baktéri kalayan kapadetan optik anu sami diterapkeun sababaraha kali ka tengah liang. Sumur on coverslips disiapkeun luyu jeung prosedur dijelaskeun dina ref. 45 (tingali Émbaran Suplemén pikeun inpormasi anu langkung lengkep). Teras tambahkeun 1 ml sedeng LB kana panutup panutup pikeun nyegah lapisan cair teu garing. Panutup panutup anu terakhir disimpen dina tutup katutup ruangan Attofluor™ pikeun nyegah évaporasi médium nalika inkubasi. Pikeun percobaan pengecambahan, kami nganggo spora, anu, saatos ékspérimén konvensional, sakapeung nutupan panutup panutup luhur. Métode anu sami dianggo pikeun kéngingkeun Sulfolobus shibatae. Tilu dinten (200 rpm, 75 ° C) budidaya awal Thiobacillus serrata dilaksanakeun dina medium 182 (DSMZ).
Sampel nanopartikel emas disiapkeun ku micellar block copolymer lithography. Proses ieu dijelaskeun sacara rinci dina Bab. 60. Sakeudeung, micelles encapsulating ion emas disintésis ku nyampur kopolimer jeung HAuCl4 dina toluene. Coverslips cleaned ieu lajeng immersed dina leyuran sarta dirawat kalayan irradiation UV ku ayana agén réduksi pikeun ménta siki emas. Tungtungna, siki emas dipelak ku cara ngahubungi panutup panutup sareng larutan cai KAuCl4 sareng étanolamin salami 16 menit, anu nyababkeun susunan kuasi périodik sareng seragam pisan tina nanopartikel emas non-bola dina infra red deukeut.
Pikeun ngarobih interferogram ka gambar OT, kami nganggo algoritma buatan bumi, sakumaha anu diwincik dina tautan. 33 sareng sayogi salaku pakét Matlab dina gudang umum di handap ieu: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket tiasa ngitung inténsitas sareng gambar OT dumasar kana interferogram anu dirékam (kaasup gambar rujukan) sareng jarak jarak kaméra.
Pikeun ngitung pola fase dilarapkeun ka SLM pikeun ménta hiji profil hawa dibikeun, kami dipaké saméméhna dimekarkeun algoritma homemade39,42 nu sadia dina Repository publik handap: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Input nyaéta médan suhu anu dipikahoyong, anu tiasa diatur sacara digital atanapi nganggo gambar bmp monochrome.
Pikeun ngabagi sél sareng ngukur beurat garingna, kami nganggo algoritma Matlab anu diterbitkeun dina gudang umum di handap ieu: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Dina unggal gambar, pamaké kudu klik dina baktéri atawa mCFU dipikaresep, nyaluyukeun sensitipitas wand, sarta mastikeun seleksi.
Kanggo inpo nu langkung lengkep ihwal desain ulikan, tingali abstrak Laporan Panalungtikan Alam numbu ka artikel ieu.
Data anu ngadukung hasil panalungtikan ieu sayogi ti pangarang masing-masing upami diperyogikeun.
Kodeu sumber anu digunakeun dina ulikan ieu diwincik dina bagian Métode, sareng versi debug tiasa diunduh tina https://github.com/baffou/ dina repositori ieu: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, sareng CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight kana thermophiles sarta aplikasi spéktrum lega maranéhanana. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Insight kana thermophiles sarta aplikasi spéktrum lega maranéhanana.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. sarta Sharma, AK Ihtisar thermophiles sarta aplikasi lega maranéhna. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. sarta Sharma AK A pamahaman jero thermophiles sarta rupa-rupa aplikasi.3 Biotéhnologi 6, 81 (2016).
waktos pos: Sep-26-2022