Panyakit Alzheimer (AD) kakurangan biomarker protéin anu ngagambarkeun sababaraha patofisiologi dasarna, ngahalangan kamajuan diagnosis sareng pengobatan. Di dieu, kami nganggo proteomik komprehensif pikeun ngaidentipikasi biomarker cairan cerebrospinal (CSF) anu ngagambarkeun sajumlah patofisiologi AD. Spéktrométri massa Multiplex ngaidentipikasi kira-kira 3,500 sareng kira-kira 12,000 protéin dina AD CSF sareng otak, masing-masing. Analisis jaringan tina proteome otak ngumbar 44 modul biodiversity, 15 diantarana tumpang tindih jeung proteome cairan cerebrospinal. Penanda CSF AD dina modul tumpang tindih ieu dilipat jadi lima gugus protéin, ngagambarkeun prosés patofisiologis anu béda. Synapses sareng métabolit dina otak AD turun, tapi CSF ningkat, sedengkeun myelination anu beunghar glial sareng gugus imun dina uteuk sareng CSF ningkat. Konsistensi sareng spésifisitas panyakit tina parobahan panel dikonfirmasi dina langkung ti 500 conto CSF tambahan. Grup ieu ogé ngaidentipikasi subgrup biologis dina AD asimtomatik. Gemblengna, hasil ieu mangrupikeun léngkah anu ngajangjikeun pikeun alat biomarker basis wéb pikeun aplikasi klinis di AD.
Panyakit Alzheimer (AD) mangrupikeun panyabab paling umum tina pikun neurodegeneratif sadunya sareng dicirikeun ku rupa-rupa disfungsi sistem biologis, kalebet transmisi sinaptik, kekebalan glial-mediated, sareng métabolisme mitokondria (1-3). Tapi, biomarker protéinna anu ditetepkeun masih fokus kana ngadeteksi protéin amyloid sareng tau, sahingga henteu tiasa ngagambarkeun patofisiologi anu rupa-rupa ieu. Ieu biomarkers protéin "inti" nu paling reliably diukur dina cairan cerebrospinal (CSF) ngawengku (i) amyloid béta péptida 1-42 (Aβ1-42), nu ngagambarkeun formasi plak amyloid cortical; (ii) total tau, tanda degenerasi akson; (iii) fosfo-tau (p-tau), wawakil hiperfosforilasi tau patologis (4-7). Sanajan biomarkers cairan cerebrospinal ieu geus greatly facilitated deteksi urang "ditandaan" kasakit protéin AD (4-7), aranjeunna ngan ngagambarkeun bagian leutik tina biologi kompléks balik kasakit.
Kurangna karagaman patofisiologis biomarker AD parantos nyababkeun seueur tantangan, kalebet (i) henteu mampuh pikeun ngaidentipikasi sareng ngitung heterogenitas biologis pasien AD, (ii) ukuran anu henteu cekap tina severity sareng kamajuan panyakit, khususna dina tahap preclinical, sareng ( iii) ngembangkeun ubar terapi nu gagal pikeun sakabéhna ngajawab sakabéh aspék deterioration neurological. Katergantungan urang kana patologi landmark pikeun ngajelaskeun AD tina panyakit anu aya hubunganana ngan ukur ngaleungitkeun masalah ieu. Beuki seueur bukti nunjukkeun yén kalolobaan manula sareng pikun gaduh langkung ti hiji ciri patologis turunna kognitif (8). Saloba 90% atawa leuwih jalma kalawan patologi AD ogé boga kasakit vaskular, inclusions TDP-43, atawa kasakit degenerative séjén (9). Proporsi luhur tumpang tindihna patologis ieu parantos ngaganggu kerangka diagnostik urang ayeuna pikeun pikun, sareng definisi patofisiologis anu langkung lengkep diperyogikeun.
Dina panempoan kabutuhan urgent pikeun rupa-rupa biomarkers AD, widang ieu beuki nyoko kana métode "omics" dumasar kana sistem sakabéh pikeun manggihan biomarkers. The Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP) -AD Alliance diluncurkeun dina 2014 sareng aya di payuneun program éta. Usaha multidisiplin ieu ku National Institutes of Health, akademisi, sareng industri boga tujuan pikeun ngagunakeun strategi dumasar-sistem pikeun ngahartikeun patofisiologi AD sareng ngembangkeun analisis diagnostik biodiversiti sareng strategi perlakuan (10). Salaku bagian tina proyék ieu, proteomics jaringan geus jadi alat ngajangjikeun pikeun kamajuan biomarkers basis sistem di AD. Pendekatan data-disetir unbiased ieu organizes set data proteomics kompléks kana grup atawa "modul" protéin co-diekspresikeun nu pakait sareng tipe sél husus, organél, jeung fungsi biologis (11-13). Ampir 12 studi proteomics jaringan-euyeub informasi geus dipigawé dina otak AD (13-23). Gemblengna, analisa ieu nunjukkeun yén proteome jaringan otak AD ngajaga organisasi modular anu dijaga pisan dina cohorts mandiri sareng sababaraha daérah kortikal. Salaku tambahan, sababaraha modul ieu nunjukkeun parobahan anu tiasa diulang dina kaayaanana anu aya hubunganana sareng AD dina set data, ngagambarkeun patofisiologi sababaraha panyakit. Sacara koléktif, papanggihan ieu nunjukkeun titik jangkar anu ngajangjikeun pikeun kapanggihna proteome jaringan otak salaku biomarker dumasar sistem dina AD.
Pikeun ngarobih proteome jaringan otak AD kana biomarker dumasar sistem anu mangpaat sacara klinis, kami ngagabungkeun jaringan turunan otak sareng analisis proteomik AD CSF. Pendekatan terpadu ieu nyababkeun idéntifikasi lima sét biomarker CSF anu ngajangjikeun anu aya hubunganana sareng rupa-rupa patofisiologi dumasar-otak, kalebet sinapsis, pembuluh darah, mielinasi, peradangan, sareng disfungsi jalur métabolik. Kami hasil ngasahkeun panel biomarker ieu ngaliwatan sababaraha analisa réplikasi, kalebet langkung ti 500 conto CSF tina sagala rupa panyakit neurodegenerative. Analisis validasi ieu kalebet mariksa target grup dina CSF pasien kalayan AD asimtomatik (AsymAD) atanapi nunjukkeun bukti akumulasi amyloid abnormal dina lingkungan kognitif normal. Analisis ieu nyorot heterogenitas biologis anu signifikan dina populasi AsymAD sareng ngaidentipikasi spidol panel anu tiasa ngasubtipe individu dina tahap awal panyakit. Gemblengna, hasil ieu ngagambarkeun léngkah konci dina pamekaran alat biomarker protéin dumasar kana sababaraha sistem anu tiasa suksés ngabéréskeun seueur tantangan klinis anu disanghareupan ku AD.
Tujuan utama ulikan ieu pikeun ngaidentipikasi biomarker cairan cerebrospinal anyar anu ngagambarkeun rupa-rupa patofisiologi dumasar-otak anu ngakibatkeun AD. Gambar S1 outlines metodologi panalungtikan urang, nu ngawengku (i) analisis komprehensif disetir ku papanggihan awal AD CSF jeung jaringan proteome otak pikeun ngaidentipikasi sababaraha biomarkers kasakit CSF nu patali otak, sarta (ii) réplikasi saterusna biomarkers ieu dina sababaraha cerebrospinal bebas. cohorts cairan. Panalitian anu berorientasi penemuan dimimitian ku analisa ekspresi diferensial CSF dina 20 individu normal kognitif sareng 20 penderita AD di Pusat Panaliti Panyakit Alzheimer (ADRC) Emory Goizueta Alzheimer. Diagnosis AD dihartikeun salaku impairment kognitif signifikan ku ayana low Aβ1-42 sarta tingkat elevated tina total tau na p-tau dina cairan cerebrospinal [Mean Montréal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA). )]] (Tabel S1A). Kontrol (hartosna MoCA, 26.7 ± 2.2) ngagaduhan tingkat normal biomarker CSF.
CSF manusa dicirikeun ku rentang dinamis tina kaayaanana protéin, nu albumin jeung protéin pisan loba pisan lianna bisa nyegah deteksi protéin dipikaresep (24). Pikeun ningkatkeun jero panemuan protéin, urang ngaleungitkeun 14 protéin anu paling seueur pisan tina unggal conto CSF sateuacan analisa spéktrométri massa (MS) (24). Jumlahna aya 39,805 péptida diidentifikasi ku MS, anu dipetakeun kana 3691 proteomes dina 40 sampel. Kuantifikasi protéin dilakukeun ku sababaraha tag massa tandem (TMT) panyiri (18, 25). Pikeun ngabéréskeun data anu leungit, urang ngan ukur ngalebetkeun protéin anu dikuantisasi sahenteuna 50% tina conto dina analisa salajengna, sahingga tungtungna ngitung 2875 proteomes. Kusabab bédana anu signifikan dina tingkat kelimpahan protéin total, sampel kontrol sacara statistik dianggap outlier (13) sareng henteu kalebet dina analisis salajengna. Nilai kelimpahan tina 39 sampel sésana disaluyukeun nurutkeun umur, gender, jeung kovarians bets (13-15, 17, 18, 20, 26).
Ngagunakeun analisis t-test statistik keur evaluate ekspresi diferensial dina set data regression, analisis ieu dicirikeun protéin anu tingkat kaayaanana anu nyata robah (P <0.05) antara kontrol jeung kasus AD (Table S2A). Ditémbongkeun saperti dina Gambar 1A, kaayaanana tina total 225 protéin dina AD ieu nyata ngurangan, sarta kaayaanana 303 protéin ieu nyata ngaronjat. Protéin anu dikedalkeun sacara béda ieu kalebet sababaraha spidol AD cairan cerebrospinal anu diidentifikasi sateuacana, sapertos tau protéin anu aya hubunganana mikrotubule (MAPT; P = 3.52 × 10-8), neurofilamén (NEFL; P = 6.56 × 10-3), Protéin anu aya hubunganana sareng pertumbuhan 43. (GAP43; P = 1.46 × 10-5), Asam Lemak mengikat Protéin 3 (FABP3; P = 2.00 × 10-5), Chitinase 3 kawas 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10-6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10-4) jeung faktor pertumbuhan saraf VGF (VGF; P = 4.83 × 10-3) (4-6). Najan kitu, urang ogé ngaidentipikasi target pohara penting lianna, kayaning GDP disosiasi inhibitor 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) jeung SPARC patali kalsium modular beungkeutan 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Analisis Gene Ontology (GO) tina 225 protéin anu ngirangan sacara signifikan ngungkabkeun hubungan anu caket sareng prosés cairan awak sapertos métabolisme stéroid, koagulasi getih, sareng kagiatan hormon (Gambar 1B sareng Tabel S2B). Kontras, protéin ngaronjat sacara signifikan tina 303 raket patalina jeung struktur sél jeung métabolisme énergi.
(A) Plot gunung api nembongkeun parobahan lipetan log2 (sumbu-x) relatif ka nilai P statistik -log10 (sumbu-y) diala ku uji-t, anu digunakeun pikeun ngadeteksi ekspresi diferensial antara kontrol (CT) jeung Kasus AD tina proteome CSF Sadaya protéin. Protéin kalawan tingkat nyata ngurangan (P <0.05) dina AD ditémbongkeun dina warna bulao, sedengkeun protéin kalawan nyata ngaronjat tingkat dina kasakit ditémbongkeun dina beureum. Protéin anu dipilih dilabélan. (B) Istilah GO luhur anu aya hubunganana sareng protéin sacara signifikan ngirangan (biru) sareng ningkat (beureum) dina AD. Némbongkeun tilu istilah GO kalawan z-skor pangluhurna dina widang prosés biologis, pungsi molekular, jeung komponén sélular. (C) MS diukur tingkat MAPT dina sampel CSF (kénca) jeung korelasi na jeung sampel ELISA tingkat tau (katuhu). Koefisien korelasi Pearson sareng nilai P relevan dipintonkeun. Kusabab kurangna data ELISA pikeun hiji kasus AD, angka ieu kalebet nilai pikeun 38 tina 39 kasus anu dianalisis. (D) Analisis klaster diawasan (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) disaluyukeun P <0.01) dina kontrol jeung AD CSF kapanggih sampel ngagunakeun 65 protéin paling nyata robah dina set data. Ngabakukeun, normalisasi.
Tingkat proteomik MAPT raket patalina sareng tingkat ELISA tau anu diukur sacara mandiri (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Gambar 1C), ngadukung validitas ukuran MS urang. Saatos nyerna trypsin dina tingkat protéin prékursor amyloid (APP), péptida spésifik-isoform anu dipetakeun kana terminal C tina Aβ1-40 sareng Aβ1-42 henteu tiasa diionisasi sacara éfisién (27, 28). Ku alatan éta, péptida APP anu kami idéntifikasi teu aya hubunganana sareng tingkat ELISA Aβ1-42. Pikeun meunteun éksprési diferensial unggal kasus, kami nganggo protéin anu dikedalkeun sacara béda kalayan P <0.0001 [tingkat penemuan palsu (FDR) dilereskeun P <0.01] pikeun ngalakukeun analisa klaster anu diawaskeun tina sampel (Table S2A). Sapertos anu dipidangkeun dina Gambar 1D, 65 protéin anu penting pisan ieu tiasa leres ngaklompokkeun conto dumasar kana kaayaan panyakit, iwal hiji kasus AD anu gaduh ciri kawas kontrol. Tina 65 protéin ieu, 63 ningkat dina AD, sedengkeun ngan dua (CD74 sareng ISLR) turun. Dina total, analisa cairan cerebrospinal ieu parantos ngaidentipikasi ratusan protéin dina AD anu tiasa janten biomarker panyakit.
Teras urang ngalaksanakeun analisa jaringan mandiri tina proteome otak AD. Kohort otak panemuan ieu kalebet dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) tina kontrol (n = 10), kasakit Parkinson (PD; n = 10), campuran AD / PD (n = 10) sareng AD (n = 10) kasus. ) Sampel. Emery Goizueta ADRC. Démografi 40 kasus ieu parantos dijelaskeun sateuacana (25) sareng diringkeskeun dina Tabel S1B. Kami nganggo TMT-MS pikeun nganalisis jaringan otak 40 ieu sareng cohort réplikasi tina 27 kasus. Dina total, dua set data otak ieu ngahasilkeun 227,121 péptida unik, anu dipetakeun kana 12,943 proteomes (25). Ngan maranéhanana protéin anu diitung dina sahanteuna 50% kasus anu kaasup dina investigations saterusna. Set data papanggihan ahir ngandung 8817 protéin kuantitatif. Saluyukeun tingkat kaayaanana protéin dumasar kana umur, gender, sareng interval post-mortem (PMI). Analisis éksprési diferensial tina set data sanggeus régrési némbongkeun yén> 2000 tingkat protéin anu nyata robah [P <0.05, analisis varian (ANOVA)] dina dua atawa leuwih cohorts kasakit. Teras, urang ngalaksanakeun analisa klaster anu diawaskeun dumasar kana protéin anu dikedalkeun sacara béda, sareng P <0.0001 dina perbandingan AD / kontrol sareng / atanapi AD / PD (Gambar S2, A sareng B, Tabel S2C). 165 protéin anu dirobih pisan ieu jelas ngagambarkeun kasus patologi AD tina conto kontrol sareng PD, mastikeun perobahan khusus AD anu kuat dina sakabéh proteome.
Kami teras nganggo algoritma anu disebut Weighted Gene Co-Expression Network Analysis (WGCNA) pikeun ngalakukeun analisa jaringan dina proteome otak anu kapanggih, anu ngatur set data kana modul protéin kalayan pola ekspresi anu sami (11-13). Analisis ngaidentipikasi 44 modul (M) protéin co-diekspresikeun, diurutkeun sareng wilanganana tina panggedena (M1, n = 1821 protéin) dugi ka pangleutikna (M44, n = 34 protéin) (Gambar 2A sareng Tabel S2D). Sakumaha didadarkeun di luhur (13) Ngitung profil éksprési wawakil atawa protéin karakteristik unggal modul, sarta correlate eta jeung kaayaan kasakit jeung Patologi AD, nyaeta, ngadegkeun aliansi of Alzheimer Panyakit Registry (CERAD) jeung Braak Score (Gambar 2B). Gemblengna, modul 17 sacara signifikan aya hubunganana sareng neuropatologi AD (P <0.05). Loba modul nu patali kasakit ieu ogé euyeub ku spidol tipe-spésifik sél (Gambar 2B). Sakumaha didadarkeun di luhur (13), pengayaan tipe sél ditangtukeun ku analisa tumpang tindihna modul jeung daptar rujukan gén tipe-spésifik sél. Gén ieu diturunkeun tina data anu diterbitkeun dina neuron beurit terasing, sél endothelial sareng glial. RNA sequencing (RNA-seq) percobaan (29).
(A) Panggihan WGCNA tina proteome otak. (B) Analisis midcorrelation biweight (BiCor) tina protéin signature modular (komponén utama mimiti éksprési protéin modular) kalawan ciri neuropathological AD (luhureun), kaasup CERAD (Aβ plak) jeung Braak (tau tangles) skor. Inténsitas korelasi positif (beureum) sareng négatip (biru) dipidangkeun ku peta panas dua warna, sareng tanda bintang nunjukkeun signifikansi statistik (P <0.05). Anggo Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (handap) pikeun meunteun asosiasi tipe sél unggal modul protéin. Inténsitas shading beureum nunjukkeun darajat pengayaan tipe sél, sareng tanda bintang nunjukkeun signifikansi statistik (P <0.05). Anggo metode BH pikeun ngabenerkeun nilai P anu diturunkeun tina FET. (C) analisis GO protéin modular. Prosés biologis paling raket patalina ditémbongkeun keur unggal modul atawa grup modul patali. oligo, oligodendrocyte.
Sakumpulan lima modul astrocyte sareng microglia anu aya hubunganana raket (M30, M29, M18, M24, sareng M5) nunjukkeun korelasi positif anu kuat sareng neuropathology AD (Gambar 2B). Analisis Ontologi ngaitkeun modul glial ieu sareng kamekaran sél, proliferasi, sareng kekebalan (Gambar 2C sareng Tabel S2E). Dua modul glial tambahan, M8 jeung M22, ogé niatna upregulated dina kasakit. M8 aya hubunganana pisan sareng jalur reséptor sapertos Toll, kaskade sinyal anu maénkeun peran konci dina réspon imun bawaan (30). Dina waktos anu sami, M22 raket patalina sareng modifikasi pasca-translasi. M2, anu beunghar ku oligodendrocytes, nunjukkeun korelasi positip anu kuat sareng patologi AD sareng sambungan ontologis sareng sintésis nukléosida sareng réplikasi DNA, nunjukkeun paningkatan proliferasi sél dina kasakit. Gemblengna, papanggihan ieu ngadukung élévasi modul glial anu kami kantos dititénan dina proteome jaringan AD (13, 17). Ayeuna kapanggih yén seueur modul glial anu aya hubunganana sareng AD dina jaringan nunjukkeun tingkat ekspresi anu langkung handap dina kontrol sareng kasus PD, nyorot spésifisitas panyakitna anu ningkat dina AD (Gambar S2C).
Ngan opat modul dina proteome jaringan urang (M1, M3, M10, sarta M32) anu niatna négatip correlated kalawan Patologi AD (P <0.05) (Gambar 2, B jeung C). Duanana M1 sareng M3 beunghar ku spidol neuron. M1 patali pisan jeung sinyal sinaptik, sedengkeun M3 raket patalina jeung fungsi mitokondria. Teu aya bukti pengayaan tipe sél pikeun M10 sareng M32. M32 ngagambarkeun sambungan antara M3 jeung métabolisme sél, bari M10 kacida patalina jeung tumuwuhna sél jeung fungsi microtubule. Dibandingkeun sareng AD, sadaya opat modul ningkat dina kontrol sareng PD, masihan aranjeunna perobahan AD khusus panyakit (Gambar S2C). Gemblengna, hasil ieu ngadukung turunna seueur modul-euyeub neuron anu kami kantos dititénan dina AD (13, 17). Kasimpulanana, analisa jaringan tina proteome otak anu kami mendakan ngahasilkeun modul anu dirobih khusus AD konsisten sareng pamanggihan urang sateuacana.
AD dicirikeun ku tahap asimtomatik awal (AsymAD), dimana individu nunjukkeun akumulasi amiloid tanpa turunna kognitif klinis (5, 31). Tahap asimtomatik ieu ngagambarkeun jandela kritis pikeun deteksi dini sareng intervensi. Kami saacanna nunjukkeun pelestarian modular kuat AsymAD sareng proteome jaringan otak AD dina set data mandiri (13, 17). Pikeun mastikeun yén jaringan otak anu ayeuna urang mendakan saluyu sareng ieu pamanggihan saméméhna, urang nganalisis pelestarian 44 modul dina set data replicated ti 27 organisasi DLPFC. Organisasi ieu kalebet kasus kontrol (n = 10), AsymAD (n = 8) sareng AD (n = 9). Sampel kontrol sareng AD kalebet dina analisa cohort otak panemuan urang (Table S1B), sedengkeun kasus AsymAD unik ngan ukur dina cohort réplikasi. Kasus AsymAD ieu ogé asalna tina bank otak Emory Goizueta ADRC. Sanajan kognisi éta normal dina waktu maot, tingkat amyloid éta abnormally tinggi (hartosna CERAD, 2.8 ± 0.5) (Table S1B).
Analisis TMT-MS tina 27 jaringan otak ieu nyababkeun kuantifikasi 11,244 proteomes. Itungan ahir ieu ngan ukur kalebet protéin anu diukur dina sahenteuna 50% tina sampel. set data replicated ieu ngandung 8638 (98.0%) tina 8817 protéin kauninga dina analisis otak kapanggihna urang, sarta geus ampir 3000 robah signifikan protéin antara kontrol jeung AD cohorts (P <0.05, sanggeus tés t dipasangkeun Tukey pikeun analisis varian) ( Tabél S2F). Diantara protéin anu dikedalkeun sacara béda, 910 ogé nunjukkeun parobahan tingkat anu signifikan antara AD sareng kasus kontrol proteome otak (P <0.05, saatos ANOVA Tukey dipasangkeun t-test). Perlu dicatet yén spidol 910 ieu konsisten pisan dina arah parobahan antara proteomes (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Gambar S3A). Di antara protéin ngaronjat, protéin jeung parobahan paling konsisten antara susunan data utamana anggota modul M5 jeung M18-euyeub glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, sarta GFAP). Di antara protéin anu diréduksi, anu ngagaduhan parobahan anu paling konsisten ampir sacara éksklusif anggota modul M1 (NPTX2, VGF, sareng RPH3A) anu aya hubunganana sareng sinaps. Urang salajengna diverifikasi parobahan AD patali midkine (MDK), CD44, disékrésikeun frizzled protéin patali 1 (SFRP1) jeung VGF ku blotting barat (Gambar S3B). Analisis pelestarian modul nunjukkeun yén ngeunaan 80% tina modul protéin (34/44) dina proteome otak sacara signifikan dilestarikan dina set data réplikasi (z-skor> 1.96, FDR dilereskeun P <0.05) (Gambar S3C). Opat belas modul ieu ditangtayungan husus antara dua proteomes (z-skor> 10, FDR dilereskeun P <1.0 × 10-23). Gemblengna, panemuan sareng réplikasi tingkat luhur konsistensi dina éksprési diferensial sareng komposisi modular antara proteome otak nyorot réproduksibilitas parobahan dina protéin cortex frontal AD. Salaku tambahan, éta ogé negeskeun yén AsymAD sareng panyakit anu langkung maju ngagaduhan struktur jaringan otak anu sami.
Analisis anu langkung detil ngeunaan éksprési diferensial dina set data réplikasi otak nyorot darajat signifikan tina parobahan protéin AsymAD, kalebet jumlahna aya 151 protéin anu robih sacara signifikan antara AsymAD sareng kontrol (P <0.05) (Gambar S3D). Konsisten sareng beban amiloid, APP dina otak AsymAD sareng AD ningkat sacara signifikan. MAPT ngan ukur robih sacara signifikan dina AD, anu konsisten sareng paningkatan tingkat kusut sareng korelasi anu dipikanyaho sareng turunna kognitif (5, 7). Modul-modul anu beunghar glial (M5 sareng M18) ditingali pisan dina paningkatan protéin dina AsymAD, sedengkeun modul M1 anu aya hubunganana sareng neuron mangrupikeun perwakilan anu paling ngawakilan protéin anu turun dina AsymAD. Seueur spidol AsymAD ieu nunjukkeun parobihan anu langkung ageung dina panyakit gejala. Diantara spidol ieu nyaéta SMOC1, protéin glial milik M18, anu aya hubunganana sareng tumor otak sareng kamekaran panon sareng anggota awak (32). MDK mangrupakeun faktor pertumbuhan heparin-mengikat patali tumuwuhna sél jeung angiogenesis (33), anggota sejen M18. Dibandingkeun sareng kelompok kontrol, AsymAD ningkat sacara signifikan, dituturkeun ku paningkatan AD anu langkung ageung. Kontras, protéin synaptic neuropentraxin 2 (NPTX2) sacara signifikan ngirangan dina otak AsymAD. NPTX2 saacanna dikaitkeun sareng neurodegeneration sareng ngagaduhan peran anu diakui dina nyéépkeun sinapsis excitatory (34). Gemblengna, hasil ieu nembongkeun rupa-rupa parobahan protéin preclinical béda dina AD nu sigana kamajuan jeung severity kasakit.
Nunjukkeun yen kami geus ngahontal jero signifikan sinyalna protéin dina kapanggihna proteome otak, urang nyobian ngartos leuwih lengkep tumpang tindihna jeung transcriptome AD tingkat jaringan. Ku alatan éta, urang ngabandingkeun proteome otak anu urang mendakan sareng modul anu urang saacanna dihasilkeun tina pangukuran microarray gén 18,204 dina AD (n = 308) sareng kontrol (n = 157) jaringan DLPFC (13). tumpang tindih. Dina total, kami ngaidentipikasi 20 modul RNA anu béda, seueur anu nunjukkeun pengayaan jinis sél khusus, kalebet neuron, oligodendrocytes, astrocytes, sareng microglia (Gambar 3A). Sababaraha parobahan modul ieu dina AD dipidangkeun dina Gambar 3B. Konsisten jeung analisis tumpang tindihna protéin-RNA urang saméméhna ngagunakeun proteome MS unlabeled deeper (ngeunaan 3000 protéin) (13), lolobana 44 modul dina jaringan proteome uteuk urang kapanggih aya dina jaringan transcriptome Aya henteu tumpang tindihna signifikan dina. kapanggihna urang jeung réplikasi tina 34 modul protéin nu kacida dipikagaduh dina proteome otak, ngan 14 (~ 40%) lulus uji pasti Fisher (FET) kabuktian boga tumpang tindihna signifikan sacara statistik jeung transcriptome (Gambar 3A). Cocog sareng perbaikan karusakan DNA (P-M25 sareng P-M19), tarjamahan protéin (P-M7 sareng P-M20), RNA binding / splicing (P-M16 sareng P-M21) sareng targeting protéin (P-M13 sareng P- M23) henteu tumpang tindih sareng modul dina transkriptom. Ku alatan éta, sanajan set data proteome deeper dipaké dina analisis tumpang tindihna ayeuna (13), lolobana proteome jaringan AD teu dipetakeun kana jaringan transcriptome.
(A) Hypergeometric FET nunjukkeun pengayaan spidol spésifik sél dina modul RNA tina transkriptom AD (luhureun) sareng darajat tumpang tindihna antara modul RNA (sumbu-x) sareng protéin (sumbu-y) tina otak AD. (handap). Inténsitas shading beureum nunjukkeun darajat pengayaan jinis sél dina panel luhur sareng inténsitas tumpang tindihna modul dina panel handap. Tanda bintang nunjukkeun signifikansi statistik (P <0.05). (B) Darajat korelasi antara gén karakteristik unggal modul transcriptome jeung status AD. Modul-modul anu aya di kénca nyaéta anu paling négatip pakait sareng AD (biru), sareng anu di katuhu nyaéta anu paling positif pakait sareng AD (beureum). Nilai P BH-dilereskeun log-transformasi nunjukkeun darajat signifikansi statistik unggal korelasi. (C) Modul tumpang tindih anu signifikan sareng pengayaan jinis sél anu dibagi. (D) Analisis korelasi parobahan log2 melu tina protéin dilabélan (sumbu-x) jeung RNA (sumbu-y) dina modul tumpang tindihna. Koefisien korelasi Pearson sareng nilai P relevan dipintonkeun. Mikro, mikroglia; benda langit, astrosit. CT, kontrol.
Seuseueurna modul protéin sareng RNA anu tumpang tindih ngabagi profil pengayaan jinis sél anu sami sareng arah parobahan AD anu konsisten (Gambar 3, B sareng C). Dina basa sejen, modul M1 nu patali sinaps tina proteome otak (PM1) dipetakeun kana tilu modul RNA homolog anu beunghar neuronal (R-M1, R-M9 sareng R-M16), anu aya dina AD tingkat ngurangan. Nya kitu, modul protéin M5 sareng M18 anu beunghar glial tumpang tindih sareng modul RNA anu beunghar ku astrocytes sareng spidol mikroglial (R-M3, R-M7, sareng R-M10) sareng aub pisan kana paningkatan panyakit. Fitur modular anu dibagikeun ieu antara dua sét data salajengna ngadukung pengayaan jinis sél sareng parobihan anu aya hubunganana sareng panyakit anu kami perhatikeun dina proteome otak. Nanging, kami ningali seueur béda anu signifikan antara tingkat RNA sareng protéin tina spidol individu dina modul anu dibagikeun ieu. Analisis korelasi tina éksprési diferensial tina proteomics sareng transcriptomics molekul dina modul tumpang tindih ieu (Gambar 3D) highlights inconsistency ieu. Salaku conto, APP sareng sababaraha protéin modul glial anu sanés (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, sareng SFRP1) nunjukkeun paningkatan anu signifikan dina proteome AD, tapi ampir henteu aya parobahan dina transkriptom AD. Parobihan spésifik protéin ieu tiasa raket patalina sareng plak amyloid (23, 35), nyorot proteome salaku sumber parobihan patologis, sareng parobihan ieu henteu tiasa ditingali dina transkriptom.
Saatos nganalisa sacara mandiri otak sareng proteomes CSF anu kami mendakan, kami ngalaksanakeun analisa komprehensif ngeunaan dua set data pikeun ngaidentipikasi biomarker AD CSF anu aya hubunganana sareng patofisiologi jaringan otak. Urang mimitina kudu nangtukeun tumpang tindihna dua proteomes. Sanaos katampi sacara lega yén CSF ngagambarkeun parobahan neurokimia dina otak AD (4), tingkat pasti tumpang tindihna antara otak AD sareng proteome CSF henteu jelas. Ku ngabandingkeun jumlah produk gén dibagikeun dideteksi dina dua proteomes urang, urang manggihan yén ampir 70% (n = 1936) tina protéin dicirikeun dina cairan cerebrospinal ogé diitung dina uteuk (Gambar 4A). Seuseueurna protéin anu tumpang tindih ieu (n = 1721) dipetakeun kana salah sahiji tina 44 modul éksprési tina set data otak panemuan (Gambar 4B). Saperti nu diharapkeun, genep modul otak pangbadagna (M1 mun M6) exhibited jumlah greatest tumpang tindihna CSF. Sanajan kitu, aya modul otak nu leuwih leutik (Contona, M15 jeung M29) nu ngahontal hiji gelar luhur disangka tumpang tindihna, leuwih badag batan modul otak dua kali ukuranana. Ieu ngadorong urang pikeun ngadopsi metode anu langkung rinci, didorong sacara statistik pikeun ngitung tumpang tindihna antara otak sareng cairan cerebrospinal.
(A sareng B) Protéin anu dideteksi dina otak panemuan sareng set data CSF tumpang tindih. Seuseueurna protéin anu tumpang tindih ieu pakait sareng salah sahiji tina 44 modul ko-ekspresi jaringan ko-ekspresi otak. (C) Panggihan tumpang tindihna antara proteome cairan cerebrospinal sareng proteome jaringan otak. Unggal baris peta panas ngagambarkeun analisis tumpang tindihna misah tina FET hypergeometric. Baris luhur depicts tumpang tindihna (abu / shading hideung) antara modul otak jeung sakabéh proteome CSF. Garis kadua ngagambarkeun yén tumpang tindihna antara modul otak sareng protéin CSF (berwarna beureum) sacara signifikan diatur dina AD (P <0.05). Baris katilu nunjukkeun yén tumpang tindihna antara modul otak sareng protéin CSF (warna biru) sacara signifikan turun-diatur dina AD (P <0.05). Anggo metode BH pikeun ngabenerkeun nilai P anu diturunkeun tina FET. (D) Panel modul tilepan dumasar kana asosiasi jinis sél sareng istilah GO anu aya hubunganana. Panels ieu ngandung jumlahna aya 271 protéin nu patali otak, nu boga ekspresi diferensial bermakna dina proteome CSF.
Ngagunakeun FETs single-buntut, urang ditaksir pentingna tumpang tindihna protéin antara proteome CSF jeung modul otak individu. Analisis ngungkabkeun yén jumlah modul otak 14 dina set data CSF gaduh tumpang tindih anu signifikan sacara statistik (FDR disaluyukeun P <0.05), sareng modul tambahan (M18) anu tumpang tindihna caket kana significance (FDR disaluyukeun P = 0.06) (Gambar 4C , baris luhur). Kami ogé resep kana modul anu tumpang tindih pisan sareng protéin CSF anu dibédakeun. Kituna, urang nerapkeun dua analisis FET tambahan pikeun nangtukeun mana tina (i) protéin CSF ngaronjat sacara signifikan dina AD na (ii) protéin CSF ieu nyata turun dina AD (P <0.05, dipasangkeun t test AD / kontrol) modul Brain kalawan tumpang tindihna bermakna. diantarana. Sapertos anu dipidangkeun dina barisan tengah sareng handap Gambar 4C, analisa tambahan ieu nunjukkeun yén 8 tina 44 modul otak sacara signifikan tumpang tindih sareng protéin anu ditambah dina AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, sareng M38) . ), Bari ngan dua modul (M6 jeung M15) némbongkeun tumpang tindihna bermakna jeung ngurangan protéin dina AD CSF. Saperti nu diharapkeun, sadaya 10 modul aya dina 15 modul jeung tumpang tindihna pangluhurna jeung proteome CSF. Ku alatan éta, urang nganggap yén modul 15 ieu mangrupikeun sumber hasil anu luhur tina biomarker CSF turunan otak AD.
Urang narilep 15 modul tumpang tindih ieu kana lima panels protéin badag dumasar kana jarak maranéhanana dina diagram tangkal WGCNA sarta pakaitna maranéhanana jeung tipe sél jeung ontologi gén (Gambar 4D). Panel kahiji ngandung modul anu beunghar ku spidol neuron sareng protéin anu aya hubunganana sareng sinaps (M1 sareng M12). Panel synaptic ngandung jumlahna aya 94 protéin, sarta tingkat dina proteome CSF geus robah sacara signifikan, sahingga sumber pangbadagna spidol CSF patali otak diantara lima panels. Kelompok kadua (M6 sareng M15) nunjukkeun hubungan anu caket sareng spidol sél endothelial sareng awak vaskular, sapertos "penyembuhan tatu" (M6) sareng "pangaturan réspon imun humoral" (M15). M15 ogé patali pisan jeung métabolisme lipoprotein, nu raket patalina jeung endothelium (36). Panel vaskular ngandung 34 spidol CSF anu aya hubunganana sareng uteuk. Kelompok katilu kalebet modul (M2 sareng M4) anu sacara signifikan aya hubunganana sareng spidol oligodendrocyte sareng proliferasi sél. Contona, istilah ontologi tingkat luhur M2 ngawengku "pangaturan positif réplikasi DNA" jeung "prosés biosintésis purin". Samentara éta, pamadegan M4 kaasup "diferensiasi sél glial" jeung "segregation kromosom". Panel myelination ngandung 49 spidol CSF patali uteuk.
Grup kaopat ngandung paling modul (M30, M29, M18, M24, jeung M5), sarta ampir kabéh modul anu nyata beunghar microglia jeung spidol astrocyte. Sarupa jeung panel myelination, panel kaopat ogé ngandung modul (M30, M29, jeung M18) nu raket patalina jeung proliferasi sél. Modul-modul sanés dina grup ieu aya hubunganana sareng istilah imunologis, sapertos "prosés pangaruh imun" (M5) sareng "regulasi réspon imun" (M24). Grup imun glial ngandung 42 spidol CSF patali uteuk. Tungtungna, panel panungtungan ngawengku 52 spidol nu patali otak dina opat modul (M44, M3, M33, jeung M38), sakabéh nu aya dina awak nu patali jeung neundeun énergi jeung métabolisme. Panggedéna tina modul ieu (M3) raket patalina jeung mitokondria sarta euyeub ku spidol neuron-spésifik. M38 mangrupikeun salah sahiji anggota modul anu langkung alit dina métabolisme ieu sareng ogé nunjukkeun spésifisitas neuron sedeng.
Gemblengna, lima panél ieu ngagambarkeun rupa-rupa jinis sél sareng fungsi dina korteks AD, sareng sacara koléktif ngandung 271 spidol CSF anu aya hubunganana sareng otak (Table S2G). Pikeun meunteun validitas hasil MS ieu, kami nganggo proximity extension assay (PEA), téknologi berbasis antibodi ortogonal kalayan kamampuan multiplexing, sensitipitas tinggi sareng spésifisitas, sareng nganalisa deui conto cairan cerebrospinal anu kami mendakan A sawaréh tina 271 biomarker ieu. (n = 36). Target 36 ieu nunjukkeun perobahan dina sababaraha AD tina kacang polong, anu raket patalina jeung papanggihan basis MS urang (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), Nu niatna diverifikasi hasil analisis MS komprehensif kami (Gambar S4). ).
Téma biologis anu ditekenkeun ku lima kelompok urang, tina sinyal sinaptik ka métabolisme énergi, sadayana aya hubunganana sareng patogenesis AD (1-3). Ku alatan éta, sadaya modul 15 anu ngandung panél ieu aya hubunganana sareng patologi AD dina proteome otak anu kami mendakan (Gambar 2B). Anu paling kasohor nyaéta korelasi patologis positip anu luhur antara modul glial urang sareng korelasi patologis négatip anu kuat antara modul neuronal panggedéna urang (M1 sareng M3). Analisis éksprési diferensial tina proteome otak réplikasi urang (Gambar S3D) ogé nyorot protéin glial M5 sareng M18. Dina AsymAD sareng AD symptomatic, protéin glial paling ningkat sareng sinapsis anu aya hubunganana M1 Protéin paling ngirangan. Observasi ieu nunjukkeun yén 271 spidol cairan cerebrospinal kami dicirikeun dina lima grup nu patali jeung prosés kasakit dina cortex AD, kaasup nu lumangsung dina tahap awal asimtomatik.
Dina raraga hadé nganalisis arah robah tina protéin panel dina uteuk jeung cairan tulang tonggong, urang Drew handap pikeun tiap tina 15 modul tumpang tindihna: (i) kapanggih tingkat kaayaanana modul dina set data otak na (ii) modul protéin Bédana dinyatakeun dina cairan cerebrospinal (Gambar S5). Salaku disebutkeun tadi, WGCNA dipaké pikeun nangtukeun kaayaanana modul atawa nilai protéin karakteristik dina uteuk (13). Peta gunung seuneuan dipaké pikeun ngajelaskeun éksprési diferensial protéin modular dina cairan cerebrospinal (AD/kontrol). Angka ieu nunjukkeun yén tilu tina lima panel nunjukkeun tren ekspresi anu béda dina uteuk sareng cairan tulang tonggong. Dua modul panel synapse (M1 sareng M12) nunjukkeun panurunan dina tingkat kaayaanana dina otak AD, tapi sacara signifikan tumpang tindih sareng paningkatan protéin dina AD CSF (Gambar S5A). Modul-modul anu aya hubunganana sareng neuron anu ngandung métabolisme (M3 sareng M38) nunjukkeun pola ekspresi otak sareng cairan cerebrospinal anu sami teu konsisten (Gambar S5E). Panel vaskular ogé némbongkeun tren éksprési béda, sanajan modul na (M6 na M15) anu moderately ngaronjat dina otak AD sarta turun dina CSF diseased (Gambar S5B). Dua panel sésana ngandung jaringan glial badag nu protéinna konsistén up-diatur dina duanana compartments (Gambar S5, C jeung D).
Punten dicatet yén tren ieu henteu umum pikeun sadaya spidol dina panel ieu. Contona, panel synaptic ngawengku sababaraha protéin nu nyata ngurangan dina otak AD jeung CSF (Gambar S5A). Diantara spidol cairan cerebrospinal handap-diatur ieu NPTX2 na VGF of M1, sarta chromogranin B of M12. Sanajan kitu, sanajan iwal ieu, lolobana spidol synaptic urang anu elevated dina cairan tulang tonggong AD. Gemblengna, analisa ieu tiasa ngabédakeun tren anu signifikan sacara statistik dina tingkat otak sareng cairan cerebrospinal dina unggal lima panel urang. Tren ieu nyorot hubungan rumit sareng sering béda antara uteuk sareng éksprési protéin CSF dina AD.
Teras, kami nganggo analisis réplikasi MS-throughput tinggi (réplikasi CSF 1) pikeun ngahususkeun 271 set biomarker kami ka target anu paling ngajangjikeun sareng tiasa diulang (Gambar 5A). CSF salinan 1 ngandung jumlahna aya 96 sampel ti Emory Goizueta ADRC, kaasup kontrol, AsymAD, sarta AD cohort (Table S1A). Kasus AD ieu dicirikeun ku turunna kognitif hampang (hartosna MoCA, 20.0 ± 3.8), sareng parobahan biomarker AD dikonfirmasi dina cairan cerebrospinal (Table S1A). Sabalikna sareng analisis CSF anu kami mendakan, réplikasi ieu dilakukeun nganggo metode MS "single-shot" anu langkung éfisién sareng tinggi (tanpa fraksinasi off-line), kalebet protokol persiapan sampel anu saderhana anu ngaleungitkeun kabutuhan immunodepletion tina sampel individu. . Sabalikna, hiji "saluran paningkatan" imun-depleted tunggal dipaké pikeun ngagedékeun sinyal protéin kirang loba pisan (37). Sanajan éta ngurangan total cakupan proteome, metoda single-shot ieu nyata ngurangan waktu mesin sarta ngaronjatkeun jumlah sampel TMT-dilabélan nu bisa dianalisis giat (17, 38). Dina total, analisa ngaidentipikasi 6,487 péptida, anu dipetakeun kana 1,183 proteomes dina 96 kasus. Salaku kalawan analisis CSF kami kapanggih, ngan maranéhanana protéin diitung dina sahanteuna 50% tina sampel anu kaasup dina itungan saterusna, sarta data ieu regressed pikeun épék umur jeung gender. Ieu ngakibatkeun kuantifikasi ahir 792 proteomes, 95% diantarana ogé dicirikeun dina set data CSF kapanggih.
(A) Target protéin CSF nu patali otak diverifikasi dina cohort CSF replicated munggaran tur kaasup dina panel final (n = 60). (B ka E) Tingkat biomarker panel (komposit z-skor) diukur dina opat cohorts réplikasi CSF. Tés-t dipasangkeun atanapi ANOVA sareng koreksi pos Tukey dianggo pikeun ngévaluasi signifikansi statistik tina parobahan kaayaanana dina unggal analisis ulangan. CT, kontrol.
Kusabab urang museurkeun khususna pikeun pariksa 271 target CSF anu aya hubunganana sareng otak urang ngalangkungan analisa komprehensif, kami bakal ngabatesan pamariksaan salajengna ngeunaan proteome anu diréplikasi ieu kana spidol ieu. Diantara 271 protéin ieu, 100 dideteksi dina réplikasi CSF 1. Gambar S6A nunjukkeun ekspresi diferensial tina 100 spidol anu tumpang tindih antara kontrol sareng sampel réplikasi AD. Histones sinaptik sareng métabolit ningkat paling dina AD, sedengkeun protéin vaskular ngirangan paling seueur dina panyakit. Kalolobaan 100 spidol tumpang tindihna (n = 70) mertahankeun arah sarua parobahan dina dua susunan data (Gambar S6B). 70 ieu spidol CSF patali otak disahkeun (Table S2H) sakitu legana ngagambarkeun tren éksprési panel saméméhna observasi, nyaeta, pangaturan handap protéin vascular jeung up-regulasi sadaya panels séjén. Ngan 10 tina 70 protéin anu disahkeun ieu nunjukkeun parobihan dina kaayaanana AD anu bertentangan sareng tren panel ieu. Dina raraga ngahasilkeun panel anu pangalusna ngagambarkeun trend sakabéh otak sarta cairan cerebrospinal, urang ngaluarkeun 10 protéin ieu ti panel dipikaresep nu tungtungna urang diverifikasi (Gambar 5A). Ku alatan éta, panel kami pamustunganana ngawengku jumlahna aya 60 protéin diverifikasi dina dua bebas CSF AD cohorts ngagunakeun persiapan sampel béda jeung analisis platform MS. Plot éksprési z-skor tina panel ahir ieu dina salinan CSF 1 kontrol sareng kasus AD dikonfirmasi tren panel anu dititénan dina cohort CSF anu kami mendakan (Gambar 5B).
Di antara 60 protéin ieu, aya molekul anu dipikanyaho pakait sareng AD, sapertos osteopontin (SPP1), anu mangrupikeun sitokin pro-radang anu parantos aya hubunganana sareng AD dina seueur panilitian (39-41), sareng GAP43, Protéin sinaptik. anu jelas numbu ka neurodegeneration (42). Protéin anu paling diverifikasi lengkep nyaéta spidol anu aya hubunganana sareng panyakit neurodegeneratif sanés, sapertos amyotrophic lateral sclerosis (ALS) superoxide dismutase 1 (SOD1) anu aya hubunganana sareng Parkinson's disease related desaccharase (PARK7). Kami ogé parantos diverifikasi yén seueur spidol sanés, sapertos SMOC1 sareng protéin kantétan mémbran anu beunghar otak 1 (BASP1), parantos ngawatesan tautan sateuacana kana neurodegeneration. Perhatos yén kusabab kaayaanana anu rendah dina proteome CSF, sesah urang ngagunakeun metode deteksi single-shot-throughput tinggi ieu pikeun dipercaya ngadeteksi MAPT sareng protéin anu aya hubunganana sareng AD anu sanés (contona, NEFL sareng NRGN. ) ( 43, 44).
Urang teras pariksa 60 pananda panel prioritas ieu dina tilu analisa ulangan tambahan. Dina CSF Copy 2, kami nganggo TMT-MS tunggal pikeun nganalisis cohort bebas kontrol 297 sareng sampel AD ti Emory Goizueta ADRC (17). Réplikasi CSF 3 kalebet analisa ulang data TMT-MS anu sayogi tina kontrol 120 sareng penderita AD ti Lausanne, Swiss (45). Kami mendakan langkung ti dua per tilu tina 60 spidol prioritas dina unggal set data. Sanajan ulikan Swiss dipaké platform MS béda jeung métode kuantifikasi TMT (45, 46), kami niatna dihasilkeun tren panel kami dina dua nganalisa ulang (Gambar 5, C jeung D, sarta Tables S2, I, jeung J). Pikeun ngira-ngira spésifisitas panyakit grup kami, kami nganggo TMT-MS pikeun nganalisis set data réplikasi kaopat (réplikasi CSF 4), anu kalebet henteu ngan ukur kontrol (n = 18) sareng AD (n = 17) kasus, tapi ogé PD ( n = 14)), ALS (n = 18) jeung pikun frontotemporal (FTD) sampel (n = 11) (Table S1A). Kami hasil ngitung ampir dua per tilu protéin panel dina cohort ieu (38 ti 60). Hasil ieu nyorot parobahan khusus AD dina sadaya lima panel biomarker (Gambar 5E sareng Tabel S2K). Kanaékan gugus métabolit nunjukkeun spésifisitas AD anu paling kuat, dituturkeun ku gugus mielinasi sareng glial. Pikeun extent Lesser, FTD ogé nembongkeun paningkatan antara panels ieu, nu bisa ngagambarkeun parobahan jaringan poténsi sarupa (17). Kontras, ALS jeung PD némbongkeun ampir sarua myelination, glial, sarta propil metabolom salaku grup kontrol. Gemblengna, sanaos béda dina persiapan sampel, platform MS, sareng metode kuantifikasi TMT, analisa anu diulang ieu nunjukkeun yén spidol panel prioritas urang gaduh parobihan khusus AD anu konsisten dina langkung ti 500 conto CSF unik.
neurodegeneration AD geus dipikawanoh lega sababaraha taun saméméh awal gejala kognitif, jadi aya hiji kabutuhan urgent pikeun biomarkers of AsymAD (5, 31). Nanging, langkung seueur bukti nunjukkeun yén biologi AsymAD jauh tina homogen, sareng interaksi kompleks résiko sareng daya tahan nyababkeun bédana individu anu ageung dina kamajuan panyakit salajengna (47). Sanaos dianggo pikeun ngaidentipikasi kasus AsymAD, tingkat biomarker CSF inti (Aβ1-42, total tau sareng p-tau) teu acan kabuktosan tiasa ngaduga saha anu bakal maju ka pikun (4, 7), nunjukkeun langkung seueur. perlu ngawengku parabot biomarker holistik dumasar kana sababaraha aspék fisiologi otak pikeun akurat stratify résiko populasi ieu. Kituna, urang salajengna dianalisis panel biomarker AD-divalidasi kami dina populasi AsymAD of CSF salinan 1. Ieu 31 kasus AsymAD némbongkeun tingkat biomarker inti abnormal (Aβ1-42 / total tau ELISA ratio, <5.5) jeung kognisi lengkep (hartosna MoCA, 27.1). ± 2.2) (Tabel S1A). Salaku tambahan, sadaya jalma anu ngagaduhan AsymAD gaduh skor pikun klinis 0, nunjukkeun yén teu aya bukti turunna kinerja kognitif atanapi fungsional sapopoé.
Urang mimiti nganalisis tingkat panel anu disahkeun dina sadaya 96 CSF réplikasi 1, kalebet kohort AsymAD. Kami mendakan yén sababaraha panél dina grup AsymAD ngagaduhan parobihan anu ageung sapertos AD, panel vaskular nunjukkeun tren ka handap dina AsymAD, sedengkeun sadaya panél sanésna nunjukkeun tren kaluhur (Gambar 6A). Ku alatan éta, sakabéh panels némbongkeun korelasi kacida signifikan jeung ELISA Aβ1-42 sarta total tingkat tau (Gambar 6B). Sabalikna, korelasi antara grup sareng skor MoCA kawilang goréng. Salah sahiji panemuan anu langkung narik tina nganalisa ieu nyaéta sajumlah ageung kalimpahan panel dina kohort AsymAD. Ditémbongkeun saperti dina Gambar 6A, tingkat panel grup AsymAD biasana crosses tingkat panel grup kontrol jeung grup AD, némbongkeun variability rélatif luhur. Pikeun langkung ngajalajah heterogenitas AsymAD ieu, kami nerapkeun analisis Multidimensional Scaling (MDS) kana 96 réplikasi CSF 1 kasus. Analisis MDS ngamungkinkeun pikeun visualize kasaruaan antara kasus dumasar kana variabel tangtu dina set data. Pikeun analisa klaster ieu, urang ngan ukur nganggo spidol panel anu disahkeun anu gaduh parobihan anu signifikan sacara statistik (P <0.05, AD / kontrol) dina tingkat penemuan CSF sareng réplikasi 1 proteome (n = 29) (Table S2L). Analisis ieu ngahasilkeun clustering spasial jelas antara kontrol urang jeung kasus AD (Gambar 6C). Kontras, sababaraha kasus AsymAD jelas dikelompokeun dina grup kontrol, sedengkeun anu sanésna aya dina kasus AD. Pikeun ngajalajah heterogenitas AsymAD ieu, kami nganggo peta MDS kami pikeun nangtukeun dua kelompok kasus AsymAD ieu. Grup kahiji kaasup kasus AsymAD clustered ngadeukeutan ka kontrol (n = 19), sedengkeun grup kadua dicirikeun ku kasus AsymAD kalawan profil spidol ngadeukeutan AD (n = 12).
(A) Tingkat éksprési (z-skor) grup biomarker CSF dina sakabéh sampel 96 dina réplikasi CSF 1 cohort, kaasup AsymAD. Analisis varian jeung pos-koreksi Tukey ieu dipaké pikeun evaluate signifikansi statistik parobahan kaayaanana panel. (B) Analisis korelasi tingkat kelimpahan protéin panel (z-skor) kalawan skor MoCA jeung tingkat tau total di ELISA Aβ1-42 jeung CSF salinan 1 sampel. Koefisien korelasi Pearson sareng nilai P relevan dipintonkeun. (C) The MDS of 96 CSF salinan 1 kasus ieu dumasar kana tingkat kaayaanana 29 spidol panel disahkeun, nu nyata robah dina duanana kapanggihna jeung CSF salinan 1 susunan data [P <0.05 AD / kontrol (CT)]. Analisis ieu dipaké pikeun ngabagi grup AsymAD kana kontrol (n = 19) jeung AD (n = 12) subgroups. (D) Plot gunung api nembongkeun ekspresi diferensial sadaya réplikasi CSF 1 protéin kalawan log2 robah melu (x-sumbu) relatif ka -log10 nilai statistik P antara dua subgroups AsymAD. Biomarker panel diwarnaan. (E) réplikasi CSF 1 tingkat kaayaanana tina biomarkers grup pilihan anu differentially dikedalkeun antara subgroups AsymAD. Analisis varians post-disaluyukeun Tukey dipaké pikeun meunteun signifikansi statistik.
Kami nalungtik éksprési protéin diferensial antara kontrol ieu sareng kasus AsymAD sapertos AD (Gambar 6D sareng Tabel S2L). Hasil peta gunung seuneuan nunjukeun yen 14 spidol panel geus robah sacara signifikan antara dua grup. Seuseueurna spidol ieu mangrupikeun anggota sinaps sareng métabolisme. Tapi, SOD1 sareng substrat protéin kinase C anu beunghar ku alanin myristoylated (MARCKS), anu masing-masing mangrupikeun anggota myelin sareng glial gugus imun, ogé kalebet kana grup ieu (Gambar 6, D sareng E). Panel vaskular ogé nyumbangkeun dua spidol anu dikirangan sacara signifikan dina grup AsymAD sapertos AD, kalebet protéin beungkeutan AE 1 (AEBP1) sareng ngalengkepan anggota kulawarga C9. Henteu aya bédana anu signifikan antara kontrol sareng subgrup AsymAD sapertos AD dina ELISA AB1-42 (P = 0.38) sareng p-tau (P = 0.28), tapi memang aya bédana anu signifikan dina total tingkat tau (P = 0.0031). ) (Gbr. S7). Aya sababaraha pananda panel anu nunjukkeun yén parobahan antara dua subgrup AsymAD langkung signifikan tibatan tingkat tau total (contona, YWHAZ, SOD1, sareng MDH1) (Gambar 6E). Gemblengna, hasil ieu nunjukkeun yén panel anu disahkeun kami tiasa ngandung biomarker anu tiasa subtype sareng stratifikasi résiko poténsial pasien anu ngagaduhan panyakit asimtomatik.
Aya kabutuhan urgent pikeun alat biomarker dumasar sistem pikeun ngukur sareng nargétkeun rupa-rupa patofisiologi tukangeun AD. Alat-alat ieu dipiharep henteu ngan ukur ngarobih kerangka diagnostik AD kami, tapi ogé ngamajukeun nyoko kana strategi perlakuan anu épéktip, khusus pikeun pasien (1, 2). Pikeun tujuan ieu, kami nerapkeun pendekatan proteomik komprehensif anu teu bias kana otak AD sareng CSF pikeun ngaidentipikasi biomarker CSF basis wéb anu ngagambarkeun sajumlah patofisiologi dumasar-otak. Analisis kami dihasilkeun lima panels biomarker CSF, nu (i) ngagambarkeun synapses, pembuluh darah, myelin, disfungsi imun jeung métabolik; (ii) demonstrate reproducibility kuat dina platform MS béda; (iii) Témbongkeun parobahan spésifik kasakit progresif sapanjang tahap awal jeung ahir AD. Gemblengna, panemuan ieu ngagambarkeun léngkah anu ngajangjikeun pikeun ngembangkeun rupa-rupa, dipercaya, alat biomarker berorientasi wéb pikeun panalungtikan AD sareng aplikasi klinis.
Hasil kami nunjukkeun organisasi anu dijaga pisan tina proteome jaringan otak AD sareng ngadukung panggunaanana salaku jangkar pikeun pangembangan biomarker dumasar-sistem. Analisis kami nunjukkeun yén dua set data TMT-MS mandiri anu ngandung otak AD sareng AsymAD gaduh modularitas anu kuat. Papanggihan ieu manjangkeun karya urang saméméhna, nunjukkeun pelestarian modul kuat leuwih ti jaringan otak 2,000 tina sababaraha cohorts bebas dina frontal, parietal, sarta cortex temporal (17). Jaringan konsensus ieu ngagambarkeun rupa-rupa parobahan anu aya hubunganana sareng panyakit anu dititénan dina panilitian ayeuna, kalebet paningkatan modul radang anu beunghar glial sareng panurunan modul anu beunghar neuron. Sapertos panilitian ayeuna, jaringan skala ageung ieu ogé gaduh parobahan modular anu signifikan dina AsymAD, nunjukkeun rupa-rupa patofisiologi preclinical anu béda (17).
Sanajan kitu, dina kerangka dumasar sistem kacida konservatif ieu, aya leuwih rupa hétérogénitas biologis, utamana diantara individu dina tahap awal AD. Panel biomarker kami tiasa ngagambarkeun dua subgrup dina AsymAD, anu nunjukkeun ekspresi diferensial anu signifikan tina sababaraha spidol CSF. Grup kami tiasa nyorot bédana biologis antara dua subgrup ieu, anu henteu écés dina tingkat biomarker AD inti. Dibandingkeun sareng kelompok kontrol, rasio Aβ1-42 / total tau individu AsymAD ieu abnormally low. Tapi, ngan ukur tingkat tau total anu béda sacara signifikan antara dua subgrup AsymAD, sedengkeun tingkat Aβ1-42 sareng p-tau tetep sabanding. Kusabab tau CSF tinggi sigana janten prediktor gejala kognitif anu langkung saé tibatan tingkat Aβ1-42 (7), kami nyangka yén dua cohorts AsymAD tiasa gaduh résiko anu béda pikeun kamajuan panyakit. Dibikeun ukuran sampel kawates AsymAD urang sareng kurangna data longitudinal, panalungtikan satuluyna diperyogikeun pikeun yakin kana kacindekan ieu. Tapi, hasil ieu nunjukkeun yén panel CSF dumasar sistem tiasa ningkatkeun kamampuan urang pikeun sacara efektif ngastratifikasi individu dina tahap asimtomatik panyakit.
Gemblengna, papanggihan urang ngarojong peran sababaraha fungsi biologis dina pathogenesis AD. Nanging, métabolisme énérgi anu disregulasi janten téma anu penting dina sadaya lima panel labél anu disahkeun. Protéin métabolik, sapertos hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) sareng lactate dehydrogenase A (LDHA), mangrupikeun biomarker sinaptik anu paling kuat divalidasi, nunjukkeun yén paningkatan AD CSF mangrupikeun jinis kelamin anu réproduktif pisan. Pembuluh darah sareng panel glial urang ogé ngandung sababaraha spidol anu aub dina métabolisme zat oksidatif. Papanggihan ieu konsisten sareng peran konci anu dimainkeun ku prosés métabolik dina sakumna uteuk, henteu ngan ukur pikeun nyumponan paménta énergi anu luhur pikeun neuron, tapi ogé pikeun nyumponan paménta énergi anu luhur tina astrocytes sareng sél glial sanés (17, 48). Hasilna kami ngadukung bukti ngembang yén parobahan poténsial rédoks sareng gangguan jalur énergi tiasa janten hubungan inti antara sababaraha prosés konci anu aub dina patogenesis AD, kalebet gangguan mitokondria, peradangan anu dimédiasi glial, sareng karusakan Vascular (49). Salaku tambahan, biomarker cairan cerebrospinal métabolik ngandung sajumlah ageung protéin anu beunghar béda antara kontrol urang sareng subgrup AsymAD sapertos AD, nunjukkeun yén gangguan énergi sareng jalur rédoks ieu tiasa janten kritis dina tahap préclinical panyakit.
Tren panel otak sareng cairan cerebrospinal anu béda anu kami perhatikeun ogé gaduh implikasi biologis anu pikaresepeun. Sinapsis sareng métabolisme anu beunghar ku neuron nunjukkeun turunna tingkat dina otak AD sareng paningkatan jumlah cairan cerebrospinal. Nunjukkeun yén neuron beunghar ku mitokondria anu ngahasilkeun énergi dina sinapsis pikeun nyayogikeun énergi pikeun seueur sinyal khususna (50), kasaruaan propil éksprési dua grup neuron ieu diperkirakeun. Leungitna neuron sareng ékstrusi sél anu ruksak tiasa ngajelaskeun tren otak sareng panel CSF ieu dina panyakit engké, tapi aranjeunna henteu tiasa ngajelaskeun parobahan panel awal anu urang tingali (13). Hiji katerangan mungkin pikeun papanggihan ieu dina kasakit asimtomatik mimiti nyaéta pruning synaptic abnormal. Bukti anyar dina modél beurit nunjukkeun yén fagositosis synaptic anu dimédiasi ku microglia tiasa diaktipkeun sacara abnormal dina AD sareng ngakibatkeun leungitna sinaps awal dina uteuk (51). Bahan sinaptik anu dipiceun ieu tiasa akumulasi dina CSF, naha éta urang ningali kanaékan CSF dina panel neuron. Pruning synaptic anu dimédiasi imun ogé tiasa ngajelaskeun sawaréh paningkatan protéin glial anu urang tingali dina uteuk sareng cairan cerebrospinal sapanjang prosés panyakit. Salian pruning synaptic, Abnormalitas sakabéh dina jalur exocytic ogé bisa ngakibatkeun béda otak jeung ekspresi CSF tina spidol neuronal. Sajumlah panilitian nunjukkeun yén eusi exosom dina pathogenesis otak AD parantos robih (52). Jalur ekstrasélular ogé kalibet dina proliferasi Aβ (53, 54). Perhatos yén suprési sékrési éksosomal tiasa ngirangan patologi sapertos AD dina modél beurit transgenik AD (55).
Dina waktos anu sami, protéin dina panel vaskular nunjukkeun paningkatan sedeng dina otak AD, tapi sacara signifikan turun dina CSF. Disfungsi panghalang getih-otak (BBB) sabagian tiasa ngajelaskeun papanggihan ieu. Loba studi postmortem manusa bebas geus nunjukkeun ngarecahna BBB dina AD (56, 57). Panaliti ieu negeskeun rupa-rupa kagiatan abnormal anu ngurilingan lapisan sél endothelial anu disegel pageuh ieu, kalebet bocor kapilér otak sareng akumulasi perivaskular protéin anu ditanggung ku getih (57). Ieu tiasa masihan katerangan basajan pikeun protéin vaskular elevated dina uteuk, tapi teu bisa pinuh ngajelaskeun depletion protéin sarua ieu dina cairan cerebrospinal. Hiji kamungkinan nyaéta yén sistem saraf pusat aktip ngasingkeun molekul-molekul ieu pikeun ngabéréskeun masalah paningkatan peradangan sareng setrés oksidatif. Pangurangan sababaraha protéin CSF anu paling parah dina panel ieu, khususna anu kalibet dina pangaturan lipoprotein, aya hubunganana sareng inhibisi tingkat peradangan anu ngabahayakeun sareng prosés neuroprotective spésiés oksigén réaktif. Ieu leres pikeun Paroxonase 1 (PON1), énzim beungkeutan lipoprotein anu tanggung jawab pikeun ngirangan tingkat setrés oksidatif dina sirkulasi (58, 59). Alfa-1-microglobulin / bikunin prékursor (AMBP) mangrupikeun spidol sanés anu diatur sacara signifikan tina grup vaskular. Éta mangrupikeun prékursor bikunin transporter lipid, anu ogé kalibet dina suprési peradangan sareng Perlindungan neurologis (60, 61).
Sanajan rupa-rupa hipotesis metot, henteu mampuh pikeun langsung ngadeteksi mékanisme kasakit biokimia mangrupakeun watesan well-dipikawanoh analisis proteomics kapanggihna-disetir. Ku alatan éta, panalungtikan satuluyna diperlukeun pikeun confidently nangtukeun mékanisme balik panels biomarker ieu. Dina raraga pindah ka arah ngembangkeun analisis klinis basis MS, arah hareup ogé merlukeun pamakéan métode kuantitatif sasaran pikeun skala badag verifikasi biomarker, kayaning selektif atawa ngawas réaksi paralel (62). Kami nembe nganggo ngawaskeun réaksi paralel (63) pikeun méré konfirmasi seueur parobahan protéin CSF anu dijelaskeun di dieu. Sababaraha target panel prioritas diitung kalayan akurasi anu signifikan, kalebet YWHAZ, ALDOA, sareng SMOC1, anu peta kana sinaps kami, métabolisme, sareng panél peradangan masing-masing (63). Independent Data Acquisition (DIA) sareng stratégi dumasar MS sanésna ogé tiasa mangpaat pikeun verifikasi target. Bud et al. (64) Nembe nunjukkeun yén aya tumpang tindihna anu signifikan antara biomarker AD anu diidentipikasi dina set data penemuan CSF kami sareng set data DIA-MS mandiri, anu diwangun ku ampir 200 conto CSF tina tilu cohorts Éropa anu béda. Panaliti anyar ieu ngadukung poténsi panél kami pikeun ngarobih kana deteksi dumasar-MS anu dipercaya. Antibodi tradisional sareng deteksi dumasar-aptamer ogé penting pikeun pamekaran salajengna biomarker AD konci. Kusabab kaayaanana rendah CSF, langkung hese pikeun ngadeteksi biomarker ieu nganggo metode MS throughput tinggi. NEFL sareng NRGN mangrupikeun dua conto biomarker CSF anu seueur pisan, anu dipetakeun kana panel dina analisa komprehensif kami, tapi henteu tiasa dipercaya dideteksi nganggo strategi MS tunggal kami. Strategi nargetkeun dumasar kana sababaraha antibodi, sapertos PEA, tiasa ngamajukeun transformasi klinis spidol ieu.
Gemblengna, ulikan ieu nyayogikeun pendekatan proteomik anu unik pikeun idéntifikasi sareng verifikasi biomarker CSF AD dumasar kana sistem anu béda. Ngaoptimalkeun panél spidol ieu dina cohorts AD tambahan sareng platform MS tiasa ngabuktikeun ngajangjikeun pikeun ngamajukeun stratifikasi sareng perlakuan résiko AD. Studi anu ngevaluasi tingkat longitudinal panél ieu dina waktosna ogé penting pikeun nangtukeun kombinasi spidol anu pangsaéna pikeun ngangkat résiko panyakit awal sareng parobahan parah panyakit.
Iwal ti 3 sampel nu disalin ku CSF, sakabéh sampel CSF dipaké dina ulikan ieu dikumpulkeun dina naungan Emory ADRC atawa lembaga panalungtikan patali raket. Jumlahna aya opat sét sampel Emory CSF dipaké dina studi proteomik ieu. The CSF cohort kapanggih ngandung sampel ti 20 kadali cageur sarta 20 penderita AD. Salinan CSF 1 kalebet conto tina 32 kontrol séhat, 31 individu AsymAD, sareng 33 individu AD. salinan CSF 2 ngandung 147 kontrol jeung 150 sampel AD. Cohort réplikasi CSF multi-kasakit 4 kalebet 18 kontrol, 17 AD, 19 ALS, 13 PD, sareng 11 conto FTD. Nurutkeun kana perjangjian disatujuan ku Emory Universitas Institusi Review Board, sadaya pamilon ulikan Emory nampi idin informed. Numutkeun kana 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cairan cerebrospinal dikumpulkeun sareng disimpen ku tusukan lumbar. Kontrol sareng AsymAD sareng penderita AD nampi penilaian kognitif standar di Emory Cognitive Neurology Clinic atanapi Goizueta ADRC. Sampel cairan cerebrospinal maranéhanana diuji ku INNO-BIA AlzBio3 Luminex pikeun ELISA Aβ1-42, total tau jeung analisis p-tau (65). Nilai ELISA dianggo pikeun ngadukung klasifikasi diagnostik subjék dumasar kana kriteria cut-off biomarker AD (66, 67). Data demografi sareng diagnostik dasar pikeun diagnosis CSF anu sanés (FTD, ALS, sareng PD) ogé dicandak ti Emory ADRC atanapi lembaga panalungtikan anu aya hubunganana. Metadata kasus kasimpulan pikeun kasus Emory CSF ieu tiasa dipendakan dina Tabel S1A. Ciri tina réplikasi Swiss CSF 3 cohort geus diterbitkeun saméméhna (45).
CSF kapanggih sampel. Pikeun ningkatkeun jero panemuan kami tina set data CSF, konsumsi imun protéin anu seueur pisan dilakukeun sateuacan trypsinization. Pondokna, 130 μl CSF tina 40 sampel CSF individu sareng volume anu sami (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) disimpen dina kolom spin (Thermo Fisher Scientific, A89868) di kamar. suhu Inkubasi). Saatos spinning salila 15 menit, centrifuge sampel dina 1000g salila 2 menit. Alat saringan ultracentrifugal 3K (Millipore, UFC500396) digunakeun pikeun konsentrasi sampel efluen ku sentrifugasi dina 14.000g salila 30 menit. Éncér sakabéh volume sampel nepi ka 75 μl jeung saline buffered fosfat. Konsentrasi protéin dievaluasi ku cara asam bicinchoninic (BCA) nurutkeun protokol produsén (Thermo Fisher Scientific). CSF immunodepleted (60 μl) tina sakabéh 40 sampel ieu dicerna ku lysyl endopeptidase (LysC) jeung tripsin. Pondokna, sampel diréduksi jeung alkylated kalawan 1,2 μl 0,5 M tris-2 (-carboxythyl) -phosphine na 3 μl 0,8 M chloroacetamide dina 90 ° C salila 10 menit, lajeng sonicated dina cai mandi salila 15 menit. Sampel ieu diluted kalawan 193 μl 8 M uréa panyangga [8 M uréa jeung 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] nepi ka konsentrasi ahir 6 M uréa. LysC (4,5 μg; Wako) dipaké pikeun nyerna sapeuting dina suhu kamar. Sampel ieu lajeng éncér kana 1 M uréa jeung 50 mM amonium bikarbonat (ABC) (68). Tambahkeun jumlah sarua (4,5 μg) tripsin (Promega), lajeng inkubasi sampel salila 12 jam. Acidify leyuran péptida dicerna kana konsentrasi ahir 1% asam format (FA) jeung 0,1% asam trifluoroacetic (TFA) (66), lajeng nyeuseuh jeung 50 mg kolom Sep-Pak C18 (Waters) sakumaha ditétélakeun di luhur (25) . Péptida ieu lajeng élusi dina 1 ml 50% acetonitrile (ACN). Pikeun ngabakukeun kuantifikasi protéin dina bets (25), 100 μl aliquots tina sakabéh 40 sampel CSF digabungkeun pikeun ngahasilkeun sampel campuran, nu lajeng dibagi kana lima standar internal global (GIS) (48) sampel. Sadaya sampel individu sareng standar gabungan dikeringkeun ku vakum-speed tinggi (Labconco).
CSF nyalin sampel. Dayon sareng kolega Anjeun saméméhna geus digambarkeun depletion imun jeung nyerna CSF salinan 3 sampel (45, 46). Sésana réplika sampel henteu immunodepleted individual. Nyerna ieu sampel unremoved dina tripsin sakumaha ditétélakeun saméméhna (17). Pikeun unggal analisis ulang, 120 μl aliquots tina péptida eluted ti unggal sampel anu pooled babarengan jeung dibagi kana volume aliquots sarua bisa dipaké salaku standar internal global TMT-dilabélan (48). Sadaya sampel individu sareng standar gabungan dikeringkeun ku vakum-speed tinggi (Labconco). Dina raraga ningkatkeun sinyal protéin CSF-kalimpahan low, ku ngagabungkeun 125 μl ti unggal sampel, hiji "ditingkatkeun" sampel disiapkeun keur unggal analisis réplikasi [ie, sampel biologis nu mimics sampel panalungtikan, tapi jumlah sadia nyaeta leuwih badag (37, 69)] dihijikeun kana sampel CSF dicampur (17). Sampel dicampur ieu lajeng immunoremoved maké 12 ml High Pilih Top14 Abundance Protéin Lengser Résin (Thermo Fisher Scientific, A36372), dicerna sakumaha ditétélakeun di luhur, sarta kaasup dina sababaraha panyiri TMT saterusna.
waktos pos: Aug-27-2021